【摘要】：目的 探討在上皮性卵巢癌細胞中果蠅zeste基因增強子同源物2(EZH2)能否調(diào)控乳腺癌第一易感基因(BRCA1)的表達及其調(diào)控機制,明確BRCA1在EZH2介導(dǎo)的卵巢癌惡性生物學(xué)進展中的作用,從而找到抑制腫瘤進展的靶點。 方法 構(gòu)建兩個靶向沉默EZH2基因的短發(fā)夾RNA (shEZH2)質(zhì)粒表達載體,脂質(zhì)體法穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至上皮性卵巢癌細胞A2780,瞬時轉(zhuǎn)染至ES2和SKOV3細胞。實時熒光定量PCR (qPCR)、免疫印跡和細胞免疫化學(xué)法檢測下調(diào)EZH2后BRCA1在mRNA和蛋白水平的表達及細胞核內(nèi)外分布情況。胰島素樣生長因子1(IGF-1)處理細胞活化AKT1,細胞免疫化學(xué)法再次檢測EZH2和BRCA1的表達及核內(nèi)外分布情況�；瘜W(xué)合成三個靶向沉默BRCA1的小干擾RNA (siRNA),檢驗干擾效率后,脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染至轉(zhuǎn)染了shEZH2和空白對照組細胞中,MTT、Transwell小室法和流式細胞儀分別檢測下調(diào)BRCA1表達對EZH2沉默所引起的卵巢癌增殖、遷移和細胞周期改變的影響。在順鉑耐藥細胞中聯(lián)合或單獨沉默EZH2和BRCA1的表達,MTT法檢測各組細胞對順鉑敏感性的變化。 結(jié)果 1、上皮性卵巢癌細胞A2780、ES2和SKOV3中成功抑制EZH2表達后,BRCA1在mRNA水平上表達較對照組下調(diào),而在蛋白水平上明顯升高,并且存在由胞漿向胞核轉(zhuǎn)移的趨勢。 2、在轉(zhuǎn)染shEZH2的A2780細胞中成功激活A(yù)KT1表達阻斷了BRCA1蛋白的胞漿胞核轉(zhuǎn)移效應(yīng)。 3、沉默EZH2的A2780和ES2細胞中聯(lián)合敲出BRCA1基因后,細胞的增殖遷移能力較未聯(lián)合敲出BRCA1基因組增強。 4、卵巢癌順鉑耐藥細胞A2780/DDP中聯(lián)合沉默EZH2與BRCA1表達未能疊加單獨沉默二者產(chǎn)生的細胞順鉑增敏作用。 結(jié)論 上皮性卵巢癌細胞中EZH2能調(diào)控BRCA1的表達及胞漿/胞核轉(zhuǎn)移,該調(diào)控能被活化的AKT1所阻斷。BRCA1下調(diào)能部分逆轉(zhuǎn)EZH2引起的卵巢癌惡性生物學(xué)行為,提示BRCA1在EZH2發(fā)揮原癌基因的作用中起重要作用。 目的 篩選上皮性卵巢癌石蠟標(biāo)本實時熒光定量PCR實驗最適內(nèi)參基因。 方法 以real-time PCR和ovarian cancer兩個關(guān)鍵詞在Pubmed查得2010年1月到2013年3月共計128篇全文獲取十二個常用的管家基因(ACTB, GAPDH,18S rRNA, GUSB, PPIA, PBGD, PUM1, TBP, HRPT1, RPLPO, RPL13A和B2M),收集上皮性卵巢組織標(biāo)本(正常、良性、交界性和惡性)共計五十例,運用激光顯微切割技術(shù)獲取同質(zhì)性上皮性卵巢組織用于后續(xù)研究。實時定量PCR所得實驗數(shù)據(jù)用單因素方差分析或非參檢驗進行分析。NormFinder和geNorm兩個軟件進一步用于驗證候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性和實用性。 結(jié)果 上皮細胞在正常卵巢組織中占很小比例。候選內(nèi)參基因中ACTB, PPIA, RPL13A, RPLPO和TBP不受疾病進展影響而在正常、良性、交界性和惡性上皮標(biāo)本中相對穩(wěn)定表達,其中NormFinder和geNorm驗證得出ACTB, PPIA, RPLPO和TBP的穩(wěn)定組合,而最常用內(nèi)參基因GAPDH在卵巢上皮細胞中的表達不穩(wěn)定,在癌組織中的表達顯著高于其他三類組織。 結(jié)論 在上皮性卵巢腫瘤研究中推薦同質(zhì)性上皮組織的使用和實時定量PCR實驗多個內(nèi)參基因的聯(lián)合運用,例如ACTB, PPIA, RPLPO和TBP。而GAPDH由于其表達的相對不穩(wěn)定性不宜單獨用作內(nèi)參校正。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R737.31

【共引文獻】

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本文編號：2567894