【摘要】：研究背景 卵巢癌是病死率最高的婦科惡性腫瘤。目前研究認為腫瘤異質性是導致患者腫瘤耐藥,治療失敗的主要原因。腫瘤在不斷發(fā)生著異質性變化,用不變的治療模式去治療不斷變化的腫瘤,顯然不能達到徹底治愈的效果。卵巢癌也是一種異質性疾病,每一個卵巢腫瘤都可以被看成是許多遺傳和表觀遺傳性狀各異的細胞的集合。了解卵巢不同異質性亞群與腫瘤轉移、復發(fā)及預后相關的分子表型和基因圖譜特征,制定出有針對性的個體化治療方案,對腫瘤的長期控制產生極其重要的促進意義。 研究目的 1從人卵巢漿乳癌細胞系A2780和SKOV3中分別分離和篩選出具有不同侵襲、遷移能力的單細胞亞群； 2對篩選出的高、低侵襲單細胞亞群進一步進行轉移相關表型特征的檢測和驗證,以明確其能否作為卵巢癌異質性相關機制研究的細胞模型模型； 3對2組高、低侵襲單細胞亞群,進行全基因組外顯子測序(Exome Seq)分析和轉錄組測序(RNASeq),篩選出可能與卵巢癌不同侵襲能力等腫瘤異質性產生相關的候選基因,為下一步的臨床驗證打下基礎。 研究方法 1通過有限稀釋法,對2個卵巢漿乳癌細胞系A2780、SKOV3進行單細胞分選和克隆化培養(yǎng)。Transwell小室體外侵襲和遷移實驗+MTT法對分選出的單細胞亞群的侵襲、遷移能力進行初步的鑒定。根據實驗結果篩選出侵襲能力最強和最弱,并且性狀相對穩(wěn)定的單細胞亞群。 2利用MTT法和流式細胞術檢測比較高、低侵襲單細胞亞群細胞增殖能力的差異；PI和Annexin V雙標記流式細胞儀檢測、比較二者的細胞凋亡率,然后通過RealTime PCR和Western Blot檢測檢測凋亡相關蛋白Bcl-2、Caspase3及Caspase7mRNA和蛋白水平,比較高、低侵襲單細胞亞群抗凋亡能力的差異；通過檢測抗失巢凋亡蛋白TrkB和自噬活性相關蛋白Beclin1mRNA和蛋白表達水平,比較二者的抗失巢凋亡能力和自噬活性的差異；MTT法檢測二者對紫杉醇和順鉑的藥物敏感性；裸鼠皮下注射腫瘤細胞,比較二者成瘤能力的差異； 3利用G顯帶技術對高、低侵襲亞群進行染色體核型分析,比較二者在染色體水平的異質性,并對各個單細胞亞群內部的均質性進行評價；對高、低侵襲單細胞亞群進行Exome Seq和RNA Seq。比較高、低侵襲亞群基因圖譜的差異,篩選出可能與卵巢癌不同侵襲能力等腫瘤異質性產生相關的候選基因,為將來的臨床驗證打下基礎。 研究結果 1.通過有限稀釋法,在常規(guī)細胞培養(yǎng)條件下,分別從卵巢漿乳癌細胞系A2780及SKOV3經單細胞分離和克隆化培養(yǎng),得到45個和40個單細胞亞群。經外侵襲、遷移能力實驗的鑒定、篩選,得到侵襲、遷移能力差異最大,且性狀相對穩(wěn)定的單細胞亞群,分別命名為A-H, S-H,以及A-L, S-L。篩選出的單細胞亞群經連續(xù)傳代至30代左右,性狀仍保持相對穩(wěn)定。 2.A-H和A-L,S-H和S-L,不但在體外侵襲、遷移能力方面,在細胞增殖、抗凋亡及失巢凋亡、自噬活性、抗藥性,以及裸鼠異體移植成瘤能力等多個轉移相關的表型特征方面,均具有顯著的異質性,高侵襲單細胞亞群表現出更強的獨立存活能力。 3.A-H和A-L, S-H和S-L,在染色體水平上也具有明顯的異質性,而4個單細胞亞群內部則表現出良好的均質性。Exome Seq數據經逐步篩選和過濾,最終在2組高、低侵襲亞群之間獲得共同差異基因變異位點共計66個(包括Indel：57個,SNP：9個)。在其中隨機選擇10個位點進行了Sanger測序驗證,發(fā)現CNTNAP1在2個高侵襲單細胞亞群存在5’-UTR區(qū)的突變,而在2個低侵襲亞群則為陰性。RNA Seq,按照P0.05, Fold change2的標準,在2組高、低侵襲單細胞亞群之間篩選到差異基因25個(包括20個基因在A-H及S-H轉錄本中同時上調,5個在A-L及S-L中同時上調)。選擇部分候選基因經Real Time PCR驗證,發(fā)現PI3K/AKT/mTOR信號傳導通路中,PIK3CA、PIK3CA、AKT3、ECM1、GPCR等基因的mRtNA在A-H及S-H中均顯著增高,腫瘤抑制基因Nur77,PTEN顯著降低。MTOR通路中,mTOR及PRKCB基因的mRNA在A-H、S-H中亦顯著增高。結果與RNA Seq結果一致。Western Blot結果在蛋白水平再次說明了RNA Seq結果可信。 研究結論 1人卵巢漿乳癌細胞系中存在著具有不同侵襲能力的異質性細胞亞群。 2A-H/S-H與A-L/S-L是較為理想的研究卵巢癌腫瘤內異質性的細胞模型。 3高侵襲細胞亞群具有更強的獨立存活能力,可能在腫瘤的浸潤,轉移和耐藥過程中發(fā)揮著更主要的作用。 4CNTNAP1基因突變,PI3K/AKT/mTOR信號傳導通路激活及其相關基因的異常表達可能與卵巢癌不同侵襲能力等腫瘤內異質性的產生相關。但有關其作用機制和臨床意義有待進一步的研究和驗證。
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R737.31

【參考文獻】

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1 韓亞玲;馮彥斌;羅曼莉;徐昕;蔡巖;王明榮;;人食管癌EC9706單克隆的分離培養(yǎng)及其生物學特性的研究[J];遺傳;2007年11期

2 李雁,湯釗猷,葉勝龍,劉銀坤,陳潔,薛瓊,黃曉武,陳軍,鮑衛(wèi)華,楊炯,高東梅;體內連續(xù)篩選法建立自發(fā)性肺轉移人肝癌細胞系[J];中華醫(yī)學雜志;2002年09期

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本文編號：2550834