發(fā)布時間：2019-09-01 20:33

【摘要】：目的 研究在單獨使用siRNA或單一光動力增效劑的基礎(chǔ)上，siRNA和單一光動力增效劑聯(lián)合應(yīng)用，以增強(qiáng)基于5－氨基酮戊酸的光動力診斷（5-aminolevulinic acid photodynamicdiagnosis，ALA-PDD）的敏感性，減少ALA用量，避免與其有關(guān)的毒副作用。并為進(jìn)一步應(yīng)用多種光動力增效劑，或siRNA同多種光動力增效劑聯(lián)合應(yīng)用，提高卵巢癌細(xì)胞的熒光成像靈敏度提供實驗依據(jù)。 方法 1膠原酶消化法分離人卵巢成纖維HOF細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)人卵巢癌SK-OV-3細(xì)胞及HOF細(xì)胞。 2熒光顯微鏡檢測ALA對SK-OV-3細(xì)胞的最佳作用時間及最小有效濃度。 3以Lipofectamine RNAiMAX介導(dǎo)亞鐵螯合酶（ferrochelatase，F(xiàn)ECH）-siRNA轉(zhuǎn)染，敲減SK-OV-3細(xì)胞的FECH，應(yīng)用RT-qPCR、western blot檢測mRNA和蛋白質(zhì)水平的變化，熒光顯微鏡檢測處理后的SK-OV-3細(xì)胞與HOF細(xì)胞內(nèi)原卟啉Ⅸ（protoporphyrin，PpⅨ）熒光強(qiáng)度。 4熒光顯微鏡檢測去鐵胺（deferoxamine，DFO）、乙二胺四乙酸二鈉鈣（Ethylenediaminetetraacetic Acid Calcium Disodium Salt Hydrate，EDTA-Na2Ca）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）分別聯(lián)合ALA在SK-OV-3細(xì)胞和HOF細(xì)胞出現(xiàn)PpⅨ熒光的最佳條件及三者的增效作用差異，比較siRNA與單一光動力增效劑對SK-OV-3細(xì)胞PpⅨ蓄積和熒光成像敏感性的作用。 結(jié)果 10.3mMALA可誘導(dǎo)SK-OV-3細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)PpⅨ熒光，在誘導(dǎo)的0h至6h內(nèi)PpⅨ熒光隨時間的延長而增強(qiáng)（P0.05），6h至9h為平臺期（P0.05），9h后逐漸減弱（P0.05）。 20.3mMALA作用6h，SK-OV-3細(xì)胞的PpⅨ熒光強(qiáng)度略強(qiáng)于HOF細(xì)胞（P0.01）。 3siRNA敲減SK-OV-3細(xì)胞后，F(xiàn)ECH-mRNA降至0.05±0.01倍（P0.01），F(xiàn)ECH降至0.20±0.07倍（P0.01），與ALA聯(lián)合應(yīng)用后細(xì)胞PpⅨ熒光明顯增強(qiáng)（P0.05）；相比之下HOF細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后其PpⅨ熒光強(qiáng)度無明顯變化（P0.05）。 4DFO單獨處理SK-OV-3細(xì)胞不能增強(qiáng)PpⅨ熒光（P0.05），但聯(lián)合應(yīng)用ALA可提高熒光強(qiáng)度（P0.01），其濃度在5mM至30mM熒光強(qiáng)度基本相似（P0.05），作用時間為5h時，PpⅨ熒光最強(qiáng)（P0.05）。 5EDTA-Na2Ca單獨處理SK-OV-3細(xì)胞不能增加其PpⅨ熒光強(qiáng)度（P0.05），聯(lián)合應(yīng)用ALA則可增加熒光強(qiáng)度（P0.01），且在0mM至125mM之間細(xì)胞的PpⅨ熒光強(qiáng)度與濃度呈正相關(guān)（P0.05），，作用時間在2h至5h時，熒光強(qiáng)度無明顯變化（P0.05）。 6DMSO單獨作用于SK-OV-3細(xì)胞不能增強(qiáng)PpⅨ熒光強(qiáng)度（P0.05），聯(lián)合應(yīng)用ALA時則有增強(qiáng)作用（P0.01），DMSO的最適濃度為6%（P0.05），最佳作用時間為3h（P0.05）。 7對HOF細(xì)胞而言，DFO、EDTA-Na2Ca、DMSO各自聯(lián)合ALA均不能增強(qiáng)細(xì)胞的PpⅨ熒光（P0.05）；對SK-OV-3細(xì)胞而言，以上三者均能增強(qiáng)PpⅨ熒光強(qiáng)度，三者之間無顯著差異（P0.05），但顯著高于對HOF細(xì)胞的作用（P0.01）。 8EDTA-Na2Ca或DMSO聯(lián)合siRNA較三者單獨應(yīng)用更加有效增強(qiáng)SK-OV-3細(xì)胞的PpⅨ熒光（P0.05）；DFO聯(lián)合siRNA與單獨使用siRNA相比，SK-OV-3細(xì)胞的PpⅨ熒光強(qiáng)度無明顯增強(qiáng)（P0.05）。 結(jié)論 1ALA誘導(dǎo)SK-OV-3細(xì)胞熒光顯微鏡下產(chǎn)生PpⅨ熒光的最佳時間為6h，最低有效濃度為0.3mM；在此條件下SK-OV-3細(xì)胞比HOF細(xì)胞產(chǎn)生更強(qiáng)的PpⅨ熒光。 2Lipofectamine RNAiMAX介導(dǎo)FECH-siRNA轉(zhuǎn)染SK-OV-3細(xì)胞后可顯著敲減FECHmRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，并增強(qiáng)聯(lián)用低劑量ALA時的PpⅨ熒光強(qiáng)度；但并不增強(qiáng)HOF細(xì)胞的PpⅨ熒光強(qiáng)度。 3DFO、EDTA-Na2Ca、DMSO分別聯(lián)合ALA均能增強(qiáng)SK-OV-3細(xì)胞的PpⅨ熒光強(qiáng)度，但均不能增加HOF細(xì)胞的PpⅨ熒光強(qiáng)度。 4siRNA聯(lián)合EDTA-Na2Ca或DMSO時，與ALA存在協(xié)同效應(yīng)，而siRNA聯(lián)合DFO不能進(jìn)一步增強(qiáng)ALA的作用。 5本研究證實不同作用靶點方法的聯(lián)合應(yīng)用能更有效地提高卵巢癌細(xì)胞的PpⅨ熒光強(qiáng)度，應(yīng)用光動力增效劑可以擴(kuò)大卵巢癌細(xì)胞與正常細(xì)胞的熒光差異，從而使ALA的靶向性更加明顯且對正常細(xì)胞的損害降至更低水平。
【圖文】：

血紅[6]

各實驗組平均OD值以ALA-PpⅨ熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)后可見ALA作用時間在2～6h之間時，PpⅨ特異性紅色熒光的強(qiáng)度隨作用時間的延長而增強(qiáng)，其各組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。作用時間在 6～9h 之間時，PpⅨ熒光的強(qiáng)度不再隨作用時間的延長而增強(qiáng)，各組間沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＝0.226）。作用時間超過 9h 后 PpⅨ熒光強(qiáng)度隨作用時間的延長出現(xiàn)明顯下降，10h 組與 6～9h 各實驗組間的存在統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）（圖 1－4）。
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R737.31

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2530751