【摘要】：研究背景與目的妊娠期糖尿病(Gestational diabetes mellitus,GDM)是一種常見(jiàn)的妊娠期疾病,它指妊娠前糖代謝正�；蛴袧撛谔悄土繙p退,妊娠期才出現(xiàn)或發(fā)現(xiàn)的糖尿病,我國(guó)發(fā)生率1%-5%,近年有明顯增高趨勢(shì)。近年來(lái),越來(lái)越多的流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),暴露于妊娠糖尿病母親宮內(nèi)高血糖環(huán)境的子代罹患肥胖、糖耐量異常、II型糖尿病、心血管并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)增加,從而形成了一個(gè)糖尿病產(chǎn)生糖尿病、肥胖等代謝性疾病的惡性循環(huán)。然而妊娠糖尿病子代對(duì)上述疾病易感的具體作用機(jī)制尚不清楚。目前認(rèn)為,生命發(fā)育早期的不良影響因素(如宮內(nèi)環(huán)境),通過(guò)對(duì)相關(guān)基因的表觀遺傳學(xué)修飾影響其基因表達(dá),從而影響個(gè)體出生后對(duì)某些疾病的易感性。脂代謝是機(jī)體一種重要的物質(zhì)代謝形式。肝臟與脂肪組織是機(jī)體合成脂肪的主要場(chǎng)所,而脂肪組織是機(jī)體儲(chǔ)存脂肪的主要部位。從食物中消化入血的脂肪酸與甘油磷酸進(jìn)入肝細(xì)胞或脂肪細(xì)胞,重新合成甘油三酯,并在脂肪細(xì)胞儲(chǔ)存起來(lái)。脂肪組織中的甘油三酯經(jīng)動(dòng)員后分解為磷酸甘油與脂肪酸,后者是心肌、骨骼肌運(yùn)動(dòng)所需能量的主要來(lái)源。脂肪代謝異常與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。脂代謝異�？蓪�(dǎo)致高脂蛋白血癥,引起冠心病及動(dòng)脈粥樣硬化。脂肪代謝異常也可引起肥胖癥、呼吸系統(tǒng)疾病及腎衰等。同時(shí)脂肪代謝異常也可間接引起機(jī)體出現(xiàn)糖耐量異常乃至糖尿病的發(fā)生。PPIA(脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶A,Peptidyl-prolyl cis/trans isomerase A)是一種肽基輔氨酰順?lè)串悩?gòu)酶,具有廣泛的生物學(xué)功能,以往研究表明PPIA參與了許多人類(lèi)慢性疾病病理學(xué)的關(guān)鍵進(jìn)程。例如,在病毒感染、心血管疾病和癌癥等多種疾病中扮演重要作用。最近研究發(fā)現(xiàn),在II型糖尿病病人的血清中PPIA明顯升高,此外,3T3L1細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中PPIA分泌增加,給宮內(nèi)生長(zhǎng)受限小豬喂養(yǎng)高蛋白飲食,引起PPIA在脂肪組織中的表達(dá)以及脂肪細(xì)胞的大小增加。這些研究提示,PPIA可能與肥胖和II型糖尿病的發(fā)生有關(guān),但PPIA在肥胖發(fā)生中的具體作用及相關(guān)機(jī)制,目前尚無(wú)報(bào)道。鑒于妊娠糖尿病子代有罹患肥胖、糖尿病、心血管并發(fā)癥等代謝性疾病的風(fēng)險(xiǎn),而這些疾病與脂肪代謝均有著直接或間接的關(guān)系,因此我們推測(cè)妊娠期母體高血糖可能通過(guò)影響子代脂肪代謝從而導(dǎo)致子代對(duì)上述疾病的易感。本研究中,我們?cè)诖笫笕焉锾悄虿∧Ｐ突A(chǔ)上觀察了妊娠糖尿病對(duì)子代脂代謝的影響,并對(duì)其相關(guān)機(jī)制特別是PPIA在成脂中的作用及其相關(guān)分子機(jī)制作了進(jìn)一步的深入探索。本研究主要的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.妊娠糖尿病影響了子代脂代謝。運(yùn)用腹腔注射鏈脲霉素(Streptozotocin STZ)的方法構(gòu)建大鼠妊娠糖尿病模型,在此基礎(chǔ)上我們觀察了仔鼠的脂肪體重比,檢測(cè)了血脂的差異。結(jié)果顯示:3周齡妊娠糖尿病仔鼠的脂肪體重比以及血漿甘油三脂、游離脂肪酸和低密度膽固醇含量均顯著高于對(duì)照組仔鼠。上述結(jié)果提示妊娠糖尿病子代的脂代謝發(fā)生了改變。2.妊娠糖尿病改變了子代脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)。運(yùn)用熒光定量PCR方法檢測(cè)3周齡仔鼠脂肪組織、肝臟、心肌及骨骼肌中脂代謝相關(guān)基因的表達(dá),觀察妊娠糖尿病子代脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,妊娠糖尿病子代脂肪組織中PPIA、Slc27a1、Retn、FABP4、IRS3基因表達(dá)顯著升高,IRS1基因表達(dá)顯著降低。妊娠糖尿病子代肝臟組織中Slc27a1、CD36、FABP1、IRS2基因表達(dá)顯著降低。妊娠糖尿病子代骨骼肌組織中CD36、Slc27a1、IRS1、IRS2、IRS3基因表達(dá)均顯著降低,FABP3基因表達(dá)在雌性子代中顯著降低。妊娠糖尿病子代心肌組織中CD36、Slc27a1、FABP3、IRS1、IRS2、IRS3均顯著降低。結(jié)果表明妊娠糖尿病改變了子代脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)。特別是與脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因在脂肪組織表達(dá)顯著升高,而在利用脂肪酸的組織如肝臟、心肌、骨骼肌的表達(dá)卻顯著下降,提示妊娠糖尿病可能通過(guò)影響脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)功能從而引起子代脂代謝紊亂。肥胖相關(guān)基因PPIA的表達(dá)在脂肪組織中顯著升高,可能的相關(guān)機(jī)制目前尚無(wú)報(bào)道。3.妊娠糖尿病子代脂肪組織中PPIA表達(dá)升高的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。為探討妊娠糖尿病子代脂肪組織中PPIA基因表達(dá)升高的可能機(jī)制,我們通過(guò)http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hg Gateway網(wǎng)站對(duì)PPIA基因進(jìn)行在線分析,發(fā)現(xiàn)PPIA基因啟動(dòng)子區(qū)存在一個(gè)Cp G島。進(jìn)而我們運(yùn)用BSP方法觀察脂肪組織中PPIA基因啟動(dòng)子區(qū)Cp G島的甲基化狀態(tài)是否發(fā)生改變。結(jié)果顯示該Cp G島上的大部分Cp G位點(diǎn)處于去甲基化狀態(tài),在正常組有兩處Cp G位點(diǎn)出現(xiàn)了明顯的甲基化(p0.05),而在妊娠糖尿病組沒(méi)有出現(xiàn)甲基化。上述結(jié)果提示妊娠糖尿病子代脂肪組織中PPIA基因的表達(dá)升高可能與PPIA啟動(dòng)子區(qū)一些位點(diǎn)的去甲基化相關(guān)。但肥胖相關(guān)基因PPIA否參與了脂肪代謝以及相關(guān)分子機(jī)制如何值得我們進(jìn)一步研究。4.PPIA在脂代謝中的作用及相關(guān)分子機(jī)制為了探討PPIA對(duì)脂肪細(xì)胞分化的影響及其分子機(jī)制。首先在體外實(shí)驗(yàn)中,我們運(yùn)用穩(wěn)定干擾RNA方法將前體脂肪細(xì)胞3T3L1中內(nèi)源性的PPIA沉默,結(jié)果發(fā)現(xiàn)PPIA沉默后可明顯削弱3T3L1細(xì)胞的成脂分化能力。PPIA抑制劑Cs A同樣阻滯了3T3L1細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化。培養(yǎng)基中加入PPIA抗體對(duì)3T3L1細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化沒(méi)有明顯抑制作用,這表明是細(xì)胞內(nèi)的PPIA而不是分泌的PPIA對(duì)脂肪分化起著重要作用。進(jìn)一步運(yùn)用定量PCR方法檢測(cè)了PPIA沉默后脂肪形成因子PPARG、C/EBPA及C/EBPB的表達(dá),結(jié)果顯示在3T3L1細(xì)胞成脂分化過(guò)程中,PPIA沉默同樣明顯抑制了PPARG、C/EBPA及C/EBPB的表達(dá)。這些結(jié)果提示,PPIA對(duì)小鼠3T3L1的成脂分化有重要促進(jìn)作用,可能通過(guò)調(diào)節(jié)成脂因子如C/EBPB的表達(dá)來(lái)調(diào)控脂肪細(xì)胞分化。為進(jìn)一步證實(shí)PPIA在體外對(duì)成脂的作用及分子機(jī)制,我們通過(guò)分離培養(yǎng)PPIA-/-和PPIA+/+小鼠的胚胎纖維母細(xì)胞(MEFs)并誘導(dǎo)成脂,觀察其脂肪分化能力和脂肪形成因子表達(dá)情況。結(jié)果顯示PPIA-/-MEFs與PPIA+/+MEFs相比脂肪分化能力明顯受損。PPIA敲除后PPARG,C/EBPA和C/EBPB的表達(dá)明顯受到抑制。并且進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染PPIA-/-MEFs過(guò)表達(dá)外源PPIA后可明顯恢復(fù)PPIA-/-MEFs脂肪分化能力。結(jié)果提示PPIA有促進(jìn)小鼠MEFs成脂分化的作用。以上結(jié)果證明PPIA在體外有促進(jìn)脂肪分化的作用,其可能的分子機(jī)制是通過(guò)調(diào)節(jié)成脂因子如C/EBPB的表達(dá)來(lái)調(diào)控脂肪細(xì)胞的分化。為了闡明PPIA在體內(nèi)脂肪發(fā)育中的作用,我們利用PPIA基因敲除小鼠,通過(guò)比較PPIA KO小鼠與PPIA雜合子及野生型小鼠腹股溝及生殖腺脂肪量,以及利用計(jì)算機(jī)斷層掃描對(duì)脂肪組織三維重構(gòu),觀察PPIA KO小鼠脂肪量和脂肪分布的變化。并且運(yùn)用免疫組化的方法進(jìn)一步觀察PPIA KO小鼠脂肪細(xì)胞的大小。結(jié)果顯示,PPIA KO小鼠的腹股溝及生殖腺脂肪量均顯著少于PPIA雜合子及野生型小鼠,并且PPIA缺失型小鼠的皮下脂肪,內(nèi)臟脂肪以及總脂肪均少于野生型小鼠,其脂肪細(xì)胞也明顯小于PPIA野生型小鼠。結(jié)果提示PPIA基因可能對(duì)小鼠脂肪細(xì)胞的發(fā)育有調(diào)節(jié)作用。為了進(jìn)一步證實(shí)PPIA在體內(nèi)對(duì)脂肪代謝的作用及其分子機(jī)制。我們通過(guò)高脂飲食誘導(dǎo)肥胖的方法,觀察給予高脂飲食喂養(yǎng)后PPIA-/-小鼠和野生型小鼠體重的變化。定量PCR方法檢測(cè)高脂飲食喂養(yǎng)后腹股溝脂肪組織中脂肪形成因子的表達(dá)情況。結(jié)果顯示給予8周高脂飲食后PPIA-/-小鼠體重增加顯著少于野生型小鼠。高脂飲食4周后,PPIA-/-小鼠脂肪組織中PPARG、C/EBPA、和C/EBPB的表達(dá)也明顯低于野生型小鼠。這些結(jié)果提示小鼠中PPIA的缺乏能夠抵抗高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖,并進(jìn)一步證實(shí)在體內(nèi)PPIA同樣有促進(jìn)成脂的作用,其可能的分子機(jī)制與體外實(shí)驗(yàn)相同,都是通過(guò)調(diào)節(jié)成脂因子的表達(dá)來(lái)調(diào)控脂肪細(xì)胞的分化。綜上所述,本研究在構(gòu)建的大鼠妊娠糖尿病模型的基礎(chǔ)上證實(shí)了妊娠糖尿病對(duì)子代脂代謝產(chǎn)生了重要影響,并發(fā)現(xiàn)一些已知的脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)在子代中發(fā)生了顯著改變。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)妊娠糖尿病子代脂肪組織中PPIA表達(dá)升高可能與PPIA啟動(dòng)子區(qū)某些位點(diǎn)的去甲基化相關(guān)。本研究中,我們首次證實(shí)了PPIA是一種新的促進(jìn)脂肪形成因子,其可能通過(guò)調(diào)節(jié)PPARG、C/EBPA、C/EBPB等成脂因子的表達(dá)來(lái)調(diào)控脂肪細(xì)胞的分化。本研究不僅深化了對(duì)妊娠糖尿病宮內(nèi)高糖環(huán)境對(duì)子代脂代謝的影響及其可能機(jī)制的認(rèn)識(shí),而且提示PPIA可能是治療肥胖的新靶點(diǎn)。
【圖文】：

大鼠陰道分泌物中精子Figure1Sperminratvaginalseretions

Z 組與正常對(duì)照組仔鼠出生后第 3、8 周空腹血糖測(cè)定�！皀.s”: pBlood gclucose monitoring of offsprings of 3 and 8 weeks old. “n.s”量了實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組仔鼠在 3 周齡和 8 周齡的體重。結(jié)實(shí)驗(yàn)組仔鼠體重在 3 周齡和 8 周齡時(shí)的體重均顯著低于
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R714.256

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2521904