【摘要】：促性腺激素釋放激素(GnRH)是下丘腦-垂體-性腺軸生殖激素級聯(lián)釋放的重要調(diào)節(jié)物。Gn RH與妊娠識別、胚胎附植、妊娠維持及終止等有著直接或間接的聯(lián)系,是下丘腦-垂體-性腺軸的至關(guān)重要的促垂體激素。臨床發(fā)現(xiàn),甲狀腺素與下丘腦-垂體-性腺軸之間存在調(diào)節(jié)關(guān)容摘要系,但是確切的機制不清。通過檢測甲狀腺功能減退狀況下,大鼠下丘腦-垂體-卵巢軸激素水平變化,觀察雌性成年大鼠受孕率、流產(chǎn)率的差異,以及運用免疫組織化學(xué)及實時定量PCR測定方法對各組大鼠下丘腦-垂體-卵巢軸中的Gn RH表達、Gn RH受體在下丘腦、垂體、卵巢的分布,了解Gn RH是否為甲狀腺激素調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-卵巢軸及生殖功能的核心環(huán)節(jié)。為將來甲狀腺激素與性腺激素的相互調(diào)節(jié)機制研究打下基礎(chǔ)。材料與方法甲減及妊娠大鼠動物模型的建立實驗步驟:106只雌性SD大鼠,隨機分為2組,正常飲用水組(n=30)及0.05%丙基硫氧嘧啶(PTU)飲用水組(n=76),誘導(dǎo)成年期甲狀腺功能減退癥大鼠模型6周。隨機從兩組中抽取5只,測定甲狀腺激素,判定甲減造模是否成功。造模成功后,進一步從正常飲用水組隨機選取5只作為正常組(NG,n=5),PTU飲用水組中隨機選取5只作為甲減組(HG,n=5),剩余正常飲用水組中25只作為正常合籠組(n=25)及PTU飲用水組中71只作為甲減合籠組(n=71)通過雌雄2:1合籠建立妊娠模型,妊娠后分別歸為正常妊娠組(n=10)和甲減妊娠組(n=28)。沒有妊娠就歸為正常對照組和甲減組,最終單純甲減組43只,正常對照25只。標本制備禁食12h,腹腔麻醉,腹主動脈取血,留取腦組織、垂體、卵巢組織,其中一部分置凍存管中,立即放入液氮中,冷卻后置-80℃冰箱保存,用于實時定量PCR檢測。一部分組織使用10%甲醛液中固定,然后經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、連續(xù)切片免疫組織化學(xué)將石蠟包埋的組織標本制成3~4um厚度的切片,常規(guī)采用二甲苯脫蠟,梯度酒精脫水。置于微波爐調(diào)到中高火加熱至沸騰,冷卻15min后,再煮沸一次冷卻后即可完成抗原修復(fù)。0.3%的過氧化氫溶液處理30min以封閉內(nèi)源性過氧化物酶;1%正常兔血清封閉切片1h。滴加一抗(兔抗Gn RH多克隆抗體,)/兔抗TSHR多克隆抗體,加廣譜生物素標記的二抗,加鏈霉素一生物素-過氧化物酶復(fù)合物,DAB顯色,蘇木精輕度復(fù)染,中性樹膠封片。引物設(shè)計和反應(yīng)條件根據(jù)Genbank序列,使用Primer Premier5.0軟件設(shè)計引物,由大連Ta Ka Ra公司合成引物。引物序列見正文。RNA的提取及mRNA的合成按試劑盒說明書,使用Trizol(Invitrogen(英杰生命科技有限公司)從組織中提取RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen(英杰生命科技有限公司)合成m RNA。Real-time PCR分析使用Trizol從組織中提取RNA。按照試劑盒說明書步驟,分別加入引物及i Taq Universal SYBR Green master mix(Tli RNase H Plus)(寶生物工程大連有限公司),使用Applied Biosystems 7500/7500 Fast Real-Time PCR System(Thermo Fisher,Singapore)檢測m RNA的表達水平�；虮磉_量用2~(-ΔΔCt)相對量表示。目的基因表達水平以β-actin作為內(nèi)參進行標準化,結(jié)果以RQ值等來體現(xiàn)。ELISA法測定血清T3 T4 TSH按照藥盒說明書(上海源葉生物技術(shù)有限公司)采用ELISA法測定T3 T4 TSH。統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS16.0軟件進行分析,正態(tài)分布計量資料數(shù)據(jù)以sx±描述,偏態(tài)分布定量數(shù)據(jù)用M(P25,P75)表示,符合正態(tài)分布多組定量數(shù)據(jù)間差異比較采用單因素方差分析(One-way analysis of variance,One-way ANOVA),多組之間兩兩比較采用SNK-Q檢驗的方法,P0.05時差異有統(tǒng)計學(xué)意義不滿足正態(tài)分布的多組之間的比較采用Kruskal-Wallis檢驗,多組之間兩兩比較采用P值修正的方法。兩組和多組定性數(shù)據(jù)之間的比較采用卡方檢驗的方法。結(jié)果:⑴4組間下丘腦GnRH mRNA RQ值:通過單因素方差分析,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.412,P=0.296)⑵4組間垂體GnRH mRNA RQ值:差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.153,P=0.368)⑶4組間卵巢GnRH mRNA RQ值:差異無統(tǒng)計學(xué)意義(c=1.276,P=0.077)⑷4組間下丘腦TSH mRNA RQ值:通過單因素方差分析,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.658,P=0.596)⑸4組間垂體TSH mRNA RQ值:通過單因素方差分析,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.305,P=0.318)⑹4組間卵巢TSH mRNA RQ值:通過單因素方差分析,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.281,P=0.838)⑺正常組下丘腦、垂體、卵巢GnRH mRNA RQ值比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(c2=7.372,P=0.025);卵巢與垂體GnRH mRNA RQ值比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=0.889,P=0.374);卵巢與下丘腦GnRH mRNARQ值比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=2.666,P=0.008);垂體與下丘腦GnRH mRNA RQ值比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=1.778,P=0.075)⑻甲減組下丘腦、垂體、卵巢GnRH mRNA RQ值比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(標準c2=8.769,P=0.012);卵巢與垂體GnRH mRNA RQ值比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=1.177,P=0.239);卵巢與下丘腦GnRH mRNA RQ值比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=2.942,P=0.003);垂體與下丘腦GnRH mRNA RQ值比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=1.765,P=0.078)⑼正常妊娠組下丘腦、垂體、卵巢GnRH mRNA RQ值比較:差異有統(tǒng)計學(xué)意義(標準c2=6.144,P=0.046);卵巢與下丘腦GnRH mRNA RQ值比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=2.204,P=0.028);卵巢與垂體GnRH mRNA RQ值比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=2.205,P=0.043);垂體與下丘腦GnRH mRNA RQ值比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=0.329,P=0.742)⑽甲減妊娠組下丘腦、垂體、卵巢GnRH mRNA RQ值比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(標準c2=8.909,P=0.012);卵巢與垂體GnRH mRNA RQ值比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=1.706,P=0.088);卵巢與下丘腦GnRH mRNA RQ值比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=2.961,P=0.003);垂體與下丘腦GnRH mRNA RQ值比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=1.382,P=0.167)⑾正常組下丘腦、垂體、卵巢TSH mRNA RQ值比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=7.276,P=0.013);卵巢與垂體TSH mRNA RQ值比較:通過單因素方差分析,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=1.000);卵巢與下丘腦TSH mRNA RQ值比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.030);垂體與下丘腦TSH mRNA RQ值比較:通過單因素方差分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.026)⑿甲減組下丘腦、垂體、卵巢TSH mRNA RQ值比較,通過Kruskal-Wallis檢驗差異無統(tǒng)計學(xué)意義(X~2=2.577,P=0.276)⒀正常妊娠組下丘腦、垂體、卵巢TSH mRNA RQ值比較:差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=0.894,P=0.640)⒁甲減妊娠組下丘腦、垂體、卵巢TSH m RNA RQ值比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.907,P=0.210)⒂下丘腦GnRHR表達:ar核團在4個組中,通過單因素方差分析,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.373,P=0.774);vmh核團在4個組中,通過單因素方差分析,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.346,P=0.291);ah核團在4個組中,通過Kruskal-Wallis檢驗,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(標準c2=2.486,P=0.478);pa核團在4個組中,通過單因素方差分析,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.591,P=0.670);pmv核團在4個組中,通過單因素方差分析,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.517,P=0.676);甲減妊娠組中,通過單因素方差分析,5個核團差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.440,P=0.779);甲減組中,通過Kruskal-Wallis檢驗,5個大腦核團之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(標準c2=0.717,P=0.949);正常組中,通過單因素方差分析,5個核團差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.810,P=0.531);正常妊娠組中,通過單因素方差分析,5個核團差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.432,P=0.782)⒃垂體GnRHR表達:通過Kruskal-Wallis檢驗,4個組間積分光密度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0.37);通過Nemenyi檢驗,甲減妊娠組與甲減組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(標準X~2=0.089,P=0.929),甲減妊娠組與正常組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(標準X~2=1.809,P=0.071),甲減妊娠組與正常妊娠組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(標準X~2=2.345,P=0.019),甲減組與正常組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(標準X~2=1.720,P=0.086),甲減組與正常妊娠組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(標準X~2=2.268,P=0.023),正常組與正常妊娠組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(標準X~2=0.779,P=0.436)⒄卵巢GnRHR表達:通過單因素方差分析,4個組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.544,P=0.655)⒅下丘腦TSHR表達:ar核團在4個組中,通過單因素方差分析,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.753,P=0.536);vmh核團在4個組中,通過Kruskal-Wallis檢驗,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(標準c2=5.795,P=0.122);ah核團在4個組中,通過Kruskal-Wallis檢驗,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(標準c2=4.953,P=0.175);pa核團在4個組中,通過單因素方差分析,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.972,P=0.430);pmv核團在4個組中,通過單因素方差分析,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.100,P=0.378)⒆垂體、卵巢TSHR表達:通過單因素方差分析,4個組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.721,P=0.240);卵巢TSHR(光密度);通過單因素方差分析,4個組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.608,P=0.199)。⒇正常合籠組與甲減合籠組相比,受孕率未見明顯差異(P0.05);甲減妊娠組與正常妊娠組相比,流產(chǎn)率增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1.GnRHR在妊娠期大鼠下丘腦-垂體-卵巢軸組織中均有表達,表明GnRH在該性腺軸中除了參與卵巢產(chǎn)生的激素對垂體促性腺激素及下丘腦GnRH分泌的長反饋和調(diào)節(jié)垂體激素(LH和FSH)與下丘腦激素的短反饋外,下丘腦、垂體、卵巢內(nèi)源性Gn RH可能通過自分泌和旁分泌方式參與大鼠妊娠期的維持。2.在下丘腦各核團中,GnRHR分布無明顯差異,推測下丘腦GnRH神經(jīng)元可能對維持大鼠妊娠不起主導(dǎo)作用。3.甲狀腺功能減退癥對垂體GnRHR產(chǎn)物分布有影響,而對卵巢、下丘腦各核團中的GnRH免疫陽性產(chǎn)物分布無影響。4.4個組內(nèi)的下丘腦-垂體-卵巢中GnRH mRNA表達均有差異。甲狀腺功能減退對組間的下丘腦-垂體-卵巢中GnRH mRNA表達無影響。5.甲狀腺功能減退和妊娠因素對下丘腦-垂體-卵巢中TSH mRNA表達未發(fā)現(xiàn)有影響。甲狀腺功能減退癥對卵巢、下丘腦各核團中的TSHR分布無影響。6.甲狀腺功能減退癥對大鼠的妊娠產(chǎn)生了不利的影響。目的通過甲狀腺過氧化物酶抗體(TPOAb)的測定,觀察對甲狀腺功能正常孕早期婦女妊娠的影響。方法293例妊娠早期伴甲狀腺功能正常的婦女作為研究人群,比較抗甲狀腺過氧化物酶抗體陽性、陰性組及干預(yù)組妊娠期婦女甲狀腺功能的改變;比較三組產(chǎn)科并發(fā)癥的發(fā)生率和產(chǎn)后新生兒的臨床特征。結(jié)果本文共研究293例,分析發(fā)現(xiàn)甲狀腺過氧化物酶抗體陽性及陰性組孕婦甲狀腺功能紊亂差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),兩組產(chǎn)科并發(fā)癥之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),陰性組與干預(yù)組產(chǎn)科并發(fā)癥、新生兒臨床特征之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論甲狀腺過氧化物酶抗體陽性妊娠期婦女甲狀腺功能有向亞臨床甲狀腺功能減退發(fā)展的傾向,甲狀腺過氧化物酶抗體陽性與陰性組相比產(chǎn)科并發(fā)癥有統(tǒng)計學(xué)意義,提示甲狀腺過氧化物酶抗體陽性對妊娠產(chǎn)生不好的結(jié)果。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R714.256

【參考文獻】

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本文編號：2492841