【摘要】：研究背景 卵巢上皮癌(EOC)是致死率最高的婦科惡性腫瘤,其中75%的患者診斷時已為晚期(Ⅲ～Ⅳ)。在理想的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)的基礎(chǔ)上輔助鉑類藥物為主的聯(lián)合化療后,約60-80%的患者發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā),晚期卵巢癌患者的中位生存時間僅為16-22個月,5年生存率約為30%。腫瘤細(xì)胞對于化療藥物產(chǎn)生耐受性被認(rèn)為是造成這一現(xiàn)象的主要原因之一。近期研究的靶向藥物及小分子化合物的臨床實驗均未能顯著改善卵巢癌患者的預(yù)后。隨著腫瘤基因組圖譜的揭示,學(xué)者們對卵巢癌的研究主要致力于基因組及表觀遺傳學(xué)的變化對臨床預(yù)后的影響。但是卵巢癌化療耐藥及腫瘤復(fù)發(fā)的機制仍不清楚,從而成為卵巢癌治療中的最大障礙。 干細(xì)胞是機體內(nèi)一類具有自我更新能力和多向分化潛能的特殊細(xì)胞。根據(jù)其來源和分化能力,主要分為,胚胎干細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、以及成體干細(xì)胞。隨著腫瘤生物學(xué)的發(fā)展,上世紀(jì)學(xué)者們提出了腫瘤干細(xì)胞(CSCs)理論。大量研究發(fā)現(xiàn)腫瘤中存在的極少量的CSCs,其既擁有類似干細(xì)胞自我更新及分化的特性,又維持著腫瘤細(xì)胞的致瘤性及細(xì)胞異質(zhì)性,在腫瘤中長期處于靜息狀態(tài),可以逃避化療藥的殺傷,導(dǎo)致腫瘤的耐藥,疾病進展及復(fù)發(fā)。早在1997年Bonnet等人分離出表型為CD34+CD38的白血病干細(xì)胞,首次在細(xì)胞水平上直觀證實了腫瘤干細(xì)胞的存在。隨后,CSCs理論在許多實體瘤如乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、胰腺癌等中得到驗證,并建立了一系列CSCs分離、富集、鑒定及分子機制研究的方法。目前,CSCs的分離及富集方法主要包括：側(cè)群細(xì)胞(side population, SP)的流式分選,根據(jù)特異性的CSCs表面標(biāo)記蛋白的流式分選,以及腫瘤球形體(sphere)的培養(yǎng)等。 近年來,許多致力于尋找卵巢癌治療新途徑的學(xué)者們也將目光轉(zhuǎn)移到腫瘤干細(xì)胞,借鑒在其它實體瘤的研究中的成熟經(jīng)驗,探索了卵巢癌干細(xì)胞研究的新領(lǐng)域。目前對于卵巢癌干細(xì)胞的分選仍然是根據(jù)在其它實體瘤干細(xì)胞研究中的結(jié)果,采用表面標(biāo)記蛋白的流式分選技術(shù),使用最多的標(biāo)記物主要包括,CD133、CD117、CD44、 ALDH1、EPCAM、CD24、以及CD90等。雖然取得了一些研究進展,但由于這些標(biāo)記物均來自于其它實體瘤干細(xì)胞的研究,其對卵巢癌干細(xì)胞的分離富集作用并不十分理想,仍然存在爭論。因此,尋找卵巢癌特異性表面標(biāo)記蛋白,成功分離并鑒定卵巢癌干細(xì)胞,對于未來卵巢癌的靶向治療可能具有重大意義。 本課題在前期工作中,采用穩(wěn)定同位素標(biāo)記和以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對SP和非SP細(xì)胞的膜蛋白進行比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析,成功篩選出卵巢癌干細(xì)胞表面標(biāo)記候選蛋白——跨膜蛋白30A (transmembrane protein30A，，簡稱TMEM30A或CDC50A),并在體外實驗中對其表達陽性細(xì)胞的干細(xì)胞特性進行了初步鑒定。本研究采用流式細(xì)胞分選及無血清懸浮培養(yǎng)技術(shù),通過體內(nèi)和體外實驗,在卵巢癌細(xì)胞系和卵巢癌患者的組織和腹水中驗證CDC50A表面標(biāo)記陽性(CDC50A+) EOC細(xì)胞的sphere形成能力,自我更新能力,分化能力及致瘤能力,檢測其對順鉑的耐藥性,并分析其表達與EOC患者臨床預(yù)后的關(guān)系。并初步探討雌激素在卵巢癌干細(xì)胞微環(huán)境中的作用及其對術(shù)后卵巢癌患者臨床預(yù)后的影響。 研究方法 1、運用流式細(xì)胞學(xué)方法分析卵巢癌細(xì)胞系SKOV3, A2780, IGROV1, COC1, OVCAR3, ES2中CDC50A+細(xì)胞的比例。采用流式細(xì)胞儀分選CDC50A+及CDC50A+細(xì)胞,驗證其在HG-DMEM/10%FBS培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)后再次分化成其他亞群的能力。采用無血清懸浮培養(yǎng)的方法檢測CDC50A+及CDC50A+細(xì)胞sphere形成能力及sphere傳代能力,并運用免疫熒光及流式細(xì)胞學(xué)方法檢測SKOV3sphere對CDC50A的富集作用。流式分選出CDC50A+及CDC50A+細(xì)胞,分別等量梯度接種于NOD/SCID小鼠皮下,觀察成瘤速度,觀察終點為兩組成瘤率或成瘤大小出現(xiàn)明顯統(tǒng)計學(xué)差異。待小鼠成瘤后,再次分選出兩群細(xì)胞接種小鼠,觀察成瘤情況。流式分析移植瘤中CDC50A+細(xì)胞的比例,檢測CDC50A+及CDC50A+細(xì)胞體內(nèi)分化能力。 2、收集EOC患者卵巢癌組織及腹水,分離卵巢癌細(xì)胞,運用流式細(xì)胞學(xué)方法分析原代卵巢癌細(xì)胞中CDC50A+細(xì)胞的比例。建立原代卵巢癌細(xì)胞sphere的培養(yǎng)方法,檢測原代卵巢癌CDC50A+及CDC50A+細(xì)胞sphere形成能力及傳代能力。運用免疫熒光及流式細(xì)胞學(xué)方法檢測原代卵巢癌sphere對CDC50A的富集作用。流式分選出CDC50A+及CDC50A+細(xì)胞,分別等量梯度接種于NSG小鼠皮下,觀察成瘤速度,觀察終點為兩組成瘤率或成瘤大小出現(xiàn)明顯統(tǒng)計學(xué)差異。待小鼠成瘤后,再次分選出兩群細(xì)胞接種小鼠,觀察成瘤情況。流式分析移植瘤中CDC50A+細(xì)胞的比例,檢測CDC50A+及CDC50A+細(xì)胞體內(nèi)分化能力。 3、MTT法驗證SKOV3及ES2細(xì)胞系中CDC50A+及CDC50A-細(xì)胞對順鉑耐藥性差異,流式細(xì)胞學(xué)方法檢測不同濃度的順鉑對SKOV3/CDC50A+細(xì)胞的富集作用。流式細(xì)胞學(xué)方法檢測順鉑化療對EOC患者卵巢癌組織中CDC50A+細(xì)胞的富集作用；建立NOD/SCID小鼠卵巢癌移植瘤模型,檢測順鉑化療對小鼠移植瘤中CDC50A+細(xì)胞的富集作用。 4、運用流式細(xì)胞學(xué)方法分析EOC患者卵巢癌原位灶及轉(zhuǎn)移灶中CDC50A+細(xì)胞的比例,流式分析處于臨床治療不同階段的EOC患者組織中CDC50A+細(xì)胞比例的分布情況,免疫組化分析76例EOC患者CDC50A蛋白的表達與臨床預(yù)后的相關(guān)性。 5、采用不同濃度的雌激素作用CDC50A+細(xì)胞,檢測雌激素在維持卵巢癌干細(xì)胞的生長及自我更新中的作用。結(jié)合臨床資料,回顧性分析術(shù)后激素替代治療對卵巢癌患者的復(fù)發(fā)及生存的影響。 研究結(jié)果 1、流式檢測發(fā)現(xiàn)6種卵巢癌細(xì)胞株中均存在少量CDC50A+細(xì)胞群,其比例穩(wěn)定維持在0.4%～2%之間。流式分選出CDC50A+細(xì)胞亞群,在細(xì)胞分化條件下體外培養(yǎng)2周,再次流式分析發(fā)現(xiàn)CDC50A+細(xì)胞分化出CDC50A細(xì)胞,其陽性率仍保持原來水平,而CDC50A細(xì)胞未能分化出CDC50A+細(xì)胞,表明CDC50A+細(xì)胞具有分化潛能。無血清懸浮培養(yǎng)出SKOV3sphere,流式分選出CDC50A+及CDC50A-細(xì)胞,分別懸浮培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)CDC50A+細(xì)胞形成sphere的個數(shù)明顯多于CDC50A細(xì)胞,CDC50A+細(xì)胞形成的sphere能連續(xù)體外傳代至少4代,而CDC50A細(xì)胞形成的sphere幾乎不能傳代。免疫熒光與流式分析均證實CDC50A+細(xì)胞在SKOV3sphere表達顯著高于貼壁SKOV3細(xì)胞；體內(nèi)動物實驗進一步驗證了CDC50A+細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力明顯強于CDC50A細(xì)胞,102個CDC50A+細(xì)胞即能使NOD/SCID小鼠成瘤,而至少104個CDC50A細(xì)胞才能使NOD/SCID小鼠成瘤。CDC50A+細(xì)胞移植瘤能夠在小鼠體內(nèi)連續(xù)傳代,而CDC50A細(xì)胞移植瘤不能傳代。HE染色顯示CDC50A+細(xì)胞移植瘤與第二代移植瘤的組織學(xué)類型保持一致。流式分析顯示CDC50A+細(xì)胞移植瘤中CDC50A陽性率保持不變,而CDC50A細(xì)胞移植瘤中幾乎無CDC50A+細(xì)胞,說明CDC50A+細(xì)胞在體內(nèi)仍具有分化能力。 2、從原代卵巢癌組織及腹水中成功分離出卵巢癌細(xì)胞,流式分析顯示原代卵巢癌組織及腹水細(xì)胞中均存在CDC50A+細(xì)胞群。成功建立了原代卵巢癌細(xì)胞sphere培養(yǎng)體系,發(fā)現(xiàn)原代組織中CDC50A+細(xì)胞能形成sphere,并能連續(xù)傳代,而CDC50A細(xì)胞幾乎不能形成sphere;免疫熒光及流式細(xì)胞學(xué)檢測均證實CDC50A+細(xì)胞在原代卵巢癌sphere中的表達顯著增高。體內(nèi)動物實驗進一步驗證了原代卵巢癌CDC50A+細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力明顯強于CDC50A細(xì)胞,103個CDC50A+細(xì)胞仍能使NSG小鼠成瘤,而至少105個CDC50A細(xì)胞才能使NSG小鼠成瘤。CDC50A+細(xì)胞移植瘤能在小鼠體內(nèi)連續(xù)傳代,而CDC50A細(xì)胞移植瘤不能傳代；HE染色顯示原代CDC50A+細(xì)胞移植瘤與患者組織學(xué)類型保持一致。流式分析顯示原代CDC50A+田胞移植瘤中CDC50A陽性率保持不變,而CDC50A細(xì)胞移植瘤中幾乎無CDC50A+細(xì)胞,說明原代CDC50A+細(xì)胞在體內(nèi)仍具有分化能力。 3、MTT法對細(xì)胞耐藥性的檢測發(fā)現(xiàn),在SKOV3和ES2細(xì)胞系中CDC50A+細(xì)胞對順鉑的耐藥性明顯高于CDC50A細(xì)胞。流式細(xì)胞學(xué)檢測發(fā)現(xiàn),不同濃度的順鉑作用后的SKOV3細(xì)胞后,細(xì)胞總數(shù)減少,CDC50A陽性率卻逐漸增高,而且CDC50A+細(xì)胞絕對數(shù)基本不變。分析同一患者先期化療前后卵巢癌組織中CDC50A陽性率,發(fā)現(xiàn)順鉑化療后CDC50A+細(xì)胞比例顯著增高。動物實驗顯示,接受順鉑化療后的小鼠移植瘤增長速度顯著慢于未治療組,而移植瘤中CDC50A陽性率卻顯著高于未治療組,進一步證明了順鉑對CDC50A具有富集作用。 4、流式細(xì)胞學(xué)方法分析發(fā)現(xiàn),EOC患者卵巢癌轉(zhuǎn)移灶中CDC50A+細(xì)胞比例顯著高于原位灶。對處于臨床治療不同階段的EOC患者組織中CDC50A+細(xì)胞比例分析發(fā)現(xiàn),CDC50A+細(xì)胞在初治手術(shù)患者中平均比例為1.47%,在先期化療患者中為9.76%,而在復(fù)發(fā)的患者中為13.35%。免疫組化分析發(fā)現(xiàn)76例EOC患者中22例患者CDC50A蛋白高表達,54例患者CDC50A蛋白低表達或陰性表達。Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)CDC50A蛋白表達和術(shù)后殘余病灶是影響患者耐藥的獨立因素。Kaplan-Meier分析證實CDC50A蛋白高表達患者無進展生存時間(PFS)顯著低于CDC50A蛋白低表達患者,中位無進展生存時間分別為10個月和17個月。Cox多元回歸模型分析顯示卵巢癌FIGO分期和CDC50A蛋白表達是影響PFS獨立因素,CDC50A蛋白高表達患者發(fā)生卵巢癌復(fù)發(fā)的風(fēng)險是低表達患者的2.85倍(95%CI1.32-6.16,p0.01)。 5、采用不同濃度的雌激素作用CDC50A+細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)其對sphere的生長及自我更新能力均無顯著影響�；仡櫺圆±治鲲@示：HRT不是PFS及OS的獨立影響因素,而且不同HRT方案對EOC患者預(yù)后無明顯影響。殘余病灶大小及FIGO分期是影響無進展生存期的獨立因素。FIGO分期還是影響總生存期的獨立因素。 結(jié)論 1、CDC50A+細(xì)胞在六種卵巢癌細(xì)胞系中的表達穩(wěn)定在0.4%～2%之間,符合干細(xì)胞比例。卵巢癌細(xì)胞系中CDC50A+細(xì)胞群具有體內(nèi)外分化能力,sphere形成能力,自我更新能力等CSCs特性。CDC50A+細(xì)胞具有更強的腫瘤形成能力,并能在小鼠體內(nèi)連續(xù)傳代。 2、EOC患者原代卵巢癌細(xì)胞中能夠分離出CDC50A+細(xì)胞群,該細(xì)胞群具有體內(nèi)分化能力,sphere形成能力,自我更新能力等CSCs特性。原代卵巢癌細(xì)胞中的CDC50A+細(xì)胞具有更強的致瘤能力,且能在小鼠體內(nèi)連續(xù)傳代。 3、卵巢癌細(xì)胞系、原代卵巢癌細(xì)胞、以及動物實驗均證實順鉑對于CDC50A+細(xì)胞具有富集作用。 4、EOC患者卵巢癌轉(zhuǎn)移灶中CDC50A+細(xì)胞比例顯著高于原位灶,表明CDC50A可能與卵巢癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)。CDC50A陽性細(xì)胞的比例在復(fù)發(fā)患者中最高,其次是先期化療患者,初治手術(shù)患者的表達比例最低,進一步說明CDC50A可能與患者耐藥及復(fù)發(fā)有關(guān)。臨床分析表明,CDC50A蛋白的表達是患者耐藥及復(fù)發(fā)的獨立影響因素,高表達CDC50A的患者具有更高的復(fù)發(fā)風(fēng)險。 5、通過體外實驗發(fā)現(xiàn)：雌激素在維持CDC50A+卵巢癌干細(xì)胞的生長及自我更新中無顯著作用,其并不是維持卵巢癌干細(xì)胞的重要因子。結(jié)合臨床資料,采用回顧性病例分析發(fā)現(xiàn)術(shù)后激素替代治療對卵巢癌患者的復(fù)發(fā)及生存無明顯影響。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R737.31

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本文編號：2481455