【摘要】：研究背景卵巢癌是一種常見的婦科惡性腫瘤,其發(fā)病率在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中排列第三位,但死亡率卻位居首位�；颊咴缙跓o明顯自覺癥狀,臨床缺乏特異性的有效診斷方法,超過70%的患者初次就診時就已經(jīng)是晚期。這也是卵巢癌治療效果差,復(fù)發(fā)率和死亡率高的重要原因。因此尋找一個敏感的腫瘤標記物及潛在的治療靶點對于提高卵巢癌臨床治療療效具有重要的意義。EPS8 (epidermal growth factor receptor pathway substrate 8, EPS8),表皮生長因子受體(EGFR)通路底物8,是一種廣泛表達的多域信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白,在進化過程中高度保守。有資料顯示其在線蟲、果蠅、非洲蟾蜍以及人類細胞中均有表達。人類EPS8的編碼基因定位于12號染色體長臂2區(qū)3-4帶,含有大約821個氨基酸,其相對分子量為97KD。有研究表明,在胚胎形成過程中,原始細胞向特異性神經(jīng)外胚層和身體器官的選擇性分化,以及細胞的增殖、多形應(yīng)答可能都與EPS8的表達有關(guān)。1999年,Alvarez等人實驗發(fā)現(xiàn),在有絲分裂信號通路中有EPS8蛋白的存在。EPS8調(diào)控細胞的分化、增殖的生物學(xué)特性為其參與腫瘤細胞的發(fā)生、發(fā)展提供了分子生物學(xué)的依據(jù)。許多研究數(shù)據(jù)顯示,EPS8在胰腺癌、食管鱗癌、腺癌、口腔鱗癌、宮頸鱗癌、大腸癌等多種惡性腫瘤中表達明顯增高,與腫瘤進展以及化療的敏感程度密切相關(guān)[14-18]。有專家認為,可以通過EPS8蛋白的檢測,作為判斷腫瘤復(fù)發(fā)及預(yù)后的參考指標。那么,EPS8蛋白在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中起到了什么作用?目前國內(nèi)外研究仍未闡明。本實驗以卵巢癌手術(shù)石蠟切片及卵巢癌細胞為研究對象,采用S-P免疫組化法、實時熒光定量PCR技術(shù)(RT-PCR)、蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測卵巢癌組織及細胞中EPS8蛋白的表達,分析其表達水平與卵巢癌臨床病理因素之間的相關(guān)性；其次,以p113.7質(zhì)粒為載體,成功構(gòu)建了p113.7-EPS8 shRNA重組質(zhì)粒,為進一步研究EPS8基因?qū)β殉舶┥飳W(xué)行為的影響提供了有效技術(shù)手段；最后,以卵巢癌細胞株SKOV3作為研究對象,觀察p113.7-EPS8 shRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后卵巢癌細胞的生長增殖、細胞周期及其對順鉑敏感性的變化,進一步探索EPS8基因?qū)β殉舶┥飳W(xué)行為的影響。目的1.觀察EPS8蛋白在卵巢癌手術(shù)石蠟切片中的表達；2.觀察EPS8蛋白在卵巢癌不同細胞株中的表達；3.統(tǒng)計分析EPS8蛋白表達水平與卵巢癌臨床病理因素之間的相關(guān)性；4.構(gòu)建p113.7-EPS8 shRNA重組質(zhì)粒,觀察p113.7-EPS8 shRNA轉(zhuǎn)染前后卵巢癌細胞生長增殖、細胞周期、順鉑敏感性等生物學(xué)行為的變化。方法及內(nèi)容1.免疫組化法檢測76例卵巢上皮性癌組織、15例上皮性卵巢良性腫瘤組織及15例正常卵巢組織石蠟切片中EPS8的表達。2. RT-PCR檢測卵巢癌細胞株SKOV3、A2780、8910、8910/PM中EPS8的mRNA水平的表達情況。3. Western Blot檢測卵巢癌細胞株SKOV3、A2780、8910、8910/PM中EPS8的蛋白水平的表達情況。4.利用重組質(zhì)粒技術(shù)構(gòu)建p113.7-EPS8 shRNA重組質(zhì)粒并進行測序鑒定。5.選取EPS8蛋白表達較高的卵巢癌細胞株SKOV3,應(yīng)用siRNA技術(shù)沉默EPS8蛋白的表達后,檢測P113.7-EPS8 shRNA對SKOV3細胞的生長增殖、細胞周期、順鉑敏感性等生物學(xué)行為的影響。結(jié)果1.免疫組化結(jié)果表明,卵巢癌組織中EPS8蛋白均有不同程度的表達,細胞學(xué)定位主要為胞漿。在中晚期(Ⅲ+Ⅳ)卵巢癌患者中EPS8蛋白高表達的比例低于早期(Ⅰ+Ⅱ)卵巢癌患者,有統(tǒng)計學(xué)差異(38.2%vs.66.7%,p0.05)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的卵巢癌患者中EPS8蛋白高表達的比例低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的卵巢癌患者(37.7%vs.65.2%,p0.05)。此外,本研究數(shù)據(jù)表明,卵巢癌患者中EPS8蛋白表達水平與卵巢癌病理類型、細胞分化程度無顯著相關(guān)性(p0.05)。2.EPS8在不同卵巢癌細胞株中表達水平不同,A2780、SKOV3、8910細胞中表達水平較高,在8910/PM細胞中表達水平最低。在后續(xù)試驗中,選擇EPS8表達水平較高的SKOV3作為研究對象。3.利用重組質(zhì)粒技術(shù)構(gòu)建p113.7-EPS8 shRNA重組質(zhì)粒,測序鑒定序列正確,Western Blot檢測結(jié)果表明,隨著p113.7-EPS8 shRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時間的延長,EPS8蛋白表達水平顯著下降。4.MTT法檢測SKOV3細胞生長曲線顯示,p113.7-EPS8 shRNA轉(zhuǎn)染后SKOV3細胞生長曲線較Empty vector轉(zhuǎn)染組和空白對照組顯著減慢,提示EPS8蛋白表達降低對SKOV3細胞生長有抑制增殖的作用。5.流式細胞儀檢測各組細胞周期結(jié)果顯示,p113.7-EPS8 shRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后,G0/G1期比例顯著增高,S期比例顯著下降,提示EPS8蛋白表達下降能降低SKOV3細胞的DNA合成。6.MTT法檢測P113.7-EPS8 shRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后卵巢癌SKOV3細胞順鉑敏感性的變化結(jié)果表明,空白對照組和空質(zhì)粒組的IC50值分別為32.18μM和34.87μM,而P113.7-EPS8 shRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后卵巢癌SKOV3細胞的IC50值為14.17μM,即EPS8蛋白表達降低后,SKOV3細胞對順鉑的敏感性提高了約2.46倍。結(jié)論1.EPS8蛋白在卵巢上皮性癌組織中表達較高,主要分布于細胞質(zhì)中。對臨床病理因素的統(tǒng)計分析表明,卵巢癌組織中EPS8蛋白與卵巢癌疾病進展相關(guān)。2. p113.7-EPS8 shRNA重組質(zhì)粒特異性降低EPS8的表達水平后,顯著抑制卵巢癌SKOV3細胞的生長增殖速度。3. pll3.7-EPS8 shRNA重組質(zhì)粒特異性降低EPS8的表達水平后,能引起卵巢癌SKOV3細胞G0/G1期阻滯。4. p113.7-EPS8 shRNA重組質(zhì)粒特異性降低EPS8的表達水平后,顯著提高SKOV3細胞對順鉑的敏感性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R737.31

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本文編號：2475173