【摘要】：第一部分SNAI2與卵巢癌臨床病理因素的相關(guān)性及其與預(yù)后的關(guān)系目的：探討SNAI2與卵巢癌臨床病理因素的相關(guān)性及其與預(yù)后的關(guān)系方法：從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)提取208例漿液性卵巢癌患者的臨床資料和SNAI2的表達(dá)數(shù)據(jù),卡法檢驗(yàn)分析SNAI2的表達(dá)與年齡、組織學(xué)分級(jí)、FIGO分期和淋巴管浸潤(rùn)的相關(guān)性；同時(shí)提取TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)208例漿液性卵巢癌患者和GSE26712數(shù)據(jù)集185例漿液性卵巢癌患者的生存資料和SNAI2的表達(dá)數(shù)據(jù),Log-rank分析分析SNAI2的表達(dá)與卵巢癌患者總生存期的相關(guān)性,Kaplan-Meier法繪制生存曲線圖。結(jié)果：SNAI2的表達(dá)和患者年齡及卵巢癌組織學(xué)分級(jí)無(wú)明顯相關(guān)性；SNAI2在FIGO III-IV期卵巢癌組織中的表達(dá)明顯高于FIGO I-II期卵巢癌組織中的表達(dá),且SNAI2高表達(dá)的卵巢癌患者更容易發(fā)生淋巴管浸潤(rùn)。在TCGA數(shù)據(jù)集中,SNAI2高表達(dá)的卵巢癌患者總生存期明顯低于SNAI2氐表達(dá)的卵巢癌患者(P=0.044,HR=0.65)。這一結(jié)果在GSE26712數(shù)據(jù)集中得到進(jìn)一步確認(rèn),即SNAI2的表達(dá)與卵巢癌患者的總生存期呈明顯負(fù)相關(guān)(P=0.0017,HR=0.56)結(jié)論：SNAI2高表達(dá)是卵巢癌患者預(yù)后的一個(gè)不良因素。第二部分SNAI2相關(guān)ceRNA的篩選和鑒定目的：SNAI2相關(guān)ceRNA的篩選和鑒定方法：生物信息學(xué)預(yù)測(cè)并結(jié)合文獻(xiàn)篩選SNAI2相關(guān)ceRNA;在OVCA433和SKOV-3細(xì)胞中過(guò)表達(dá)SNAI2-3'UTR, Real-time PCR和Western Blot檢測(cè)干擾SNAI2-3'UTR前后候選基因表達(dá)水平的改變；選取受SNAI2-3'UTR正向調(diào)控的基因,在TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫(kù)檢測(cè)SNAI2和候選ceRNA在卵巢癌組織中的表達(dá)的相關(guān)性；Real-time PCR檢測(cè)能同時(shí)靶向SNAI2和MARCKS的miR-200c,miR-204, miR-211, miR-218和miR-429在OVCA433和SKOV-3細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量,選取表達(dá)量相對(duì)較高的miRNA作為候選miRNA。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)分析候選miRNA對(duì)MARCKS的抑制作用,以及SNAI2-3'UTR是否可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合候選miRNA誘導(dǎo)MARCKS的表達(dá)。結(jié)果：生物信息學(xué)預(yù)測(cè)并結(jié)合文獻(xiàn)篩選出10個(gè)SNAI2相關(guān)ceRNA,包括CDH2, FN1, KLF8, MARCKS, MMP2, PPARG, TWIST1, VIM, ZEB1和ZEB2。在OVCA433和SKOV-3細(xì)胞中過(guò)表達(dá)SNAI2-3'UTR能顯著促進(jìn)MARCKS的mRNA和蛋白表達(dá)水平。相關(guān)性分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),SNAI2和MARCKS在卵巢癌組織中的表達(dá)呈明顯正相關(guān)。且在SNAI2低表達(dá)的卵巢癌組織中,MARCKS也呈低表達(dá),而在SNAI2高表達(dá)的卵巢癌組織中,MARCKS也呈高表達(dá)。miRNA表達(dá)譜分析表明,miR-218, miR-200c和miR-429在OVCA433和SKOV-3細(xì)胞中的表達(dá)量相對(duì)較高,miR-204表達(dá)相對(duì)較低,miR-211基本不表達(dá)。我們選取miR-218, miR-200c和miR-429作為候選miRNA。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明：①miR-218和miR-200c通過(guò)結(jié)合MARCKS-3'UTR種子區(qū)結(jié)合序列,顯著抑制熒光素酶的相對(duì)活性,而miR-429對(duì)熒光素酶抑制作用相對(duì)較弱；②SNAI2-3'UTR可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-218和miR-200c,抑制miR-218和miR-200c的活性,逆轉(zhuǎn)其對(duì)熒光素酶的抑制作用。結(jié)論：SNAI2作為ceRNA誘導(dǎo)的MARCKS表達(dá)增強(qiáng)至少部分是通過(guò)抑制miR-218和miR-200c活性介導(dǎo)的。第三部分MARCKS在卵巢癌EMT中的功能分析目的：解析MARCKS在卵巢癌EMT中的作用方法：用慢病毒載體介導(dǎo)的shRNA轉(zhuǎn)染OVCA433和SKOV-3細(xì)胞,構(gòu)建MARCKS穩(wěn)定低表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,Real-time PCR和Western Blot檢測(cè)MARCKS降表達(dá)效率。羅氏實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀RTCA-CIM-Plate檢測(cè)MARCKS降表達(dá)后,卵巢癌OVCA433和SKOV-3細(xì)胞浸潤(rùn)和遷移能力的改變；同時(shí)在顯微鏡下觀測(cè)干擾MARCKS表達(dá)前后,細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變。結(jié)果：在OVCA433和SKOV-3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染MARCKS-shRNA后,MARCKS的mRNA和蛋白水平均明顯下調(diào)。功能學(xué)研究表明,下調(diào)MARCKS的表達(dá)能顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的浸潤(rùn)和遷移能力,同時(shí)細(xì)胞的形態(tài)更趨向于上皮細(xì)胞。結(jié)論：SNAI2促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生EMT的功能至少部分是通過(guò)ceRNA作用模式,誘導(dǎo)MARCKS表達(dá)介導(dǎo)。第四部分SNAI2-3'UTR在卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用研究目的：探討SNAI2-3'UTR在卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。方法：用慢病毒載體在OVCA433和SKOV-3細(xì)胞中過(guò)表達(dá)SNAI2-3'UTR,羅氏實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀RTCA-CIM-Plate檢測(cè)干擾SNAI2-3'UTR前后卵巢癌細(xì)胞浸潤(rùn)和遷移能力的改變。結(jié)果：在OVCA433和SKOV-3細(xì)胞中過(guò)表達(dá)SNAI2-3'UTR后,細(xì)胞的浸潤(rùn)能力明顯得到增強(qiáng),其遷移能力則無(wú)明顯改變。結(jié)論：SNAI2-3'UTR能顯著促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的浸潤(rùn)能力。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R737.31

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本文編號(hào)：2441105