【摘要】：研究背景 卵巢癌(ovarian cancer, OCa)是女性生殖器官腫瘤中常見的惡性腫瘤,其死亡率在婦科惡性腫瘤高居于首位。卵巢癌發(fā)病隱匿,大于2/3的患者出現(xiàn)癥狀時已經(jīng)屬于晚期。腫瘤細胞減滅術(shù)和以鉑類化療藥物為主的聯(lián)合化療是晚期卵巢癌的主要治療策略,可暫時緩解病情,然而70%的患者在3年內(nèi)復(fù)發(fā)。復(fù)發(fā)后的卵巢癌耐藥性增強,惡性程度增加,嚴重影響患者的預(yù)后及生存質(zhì)量,使患者5年生存率大大下降。因此,探討EOC的分子發(fā)病機制,尋找新型的和選擇性強的抗卵巢癌藥物,提高化療敏感性或逆轉(zhuǎn)耐藥,對指導(dǎo)卵巢癌治療具有重要意義。新型抗腫瘤藥物研究的熱點主要集中在以下兩方面：(1)針對OCa的發(fā)生發(fā)展機制,探尋新分子作用靶點；(2)從天然產(chǎn)物(植物、海洋生物等)中尋找新的活性成分。 MicroRNA(簡稱1miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長約22nt內(nèi)源性非編碼的小RNA分子,主要通過靶向到mRNA的3'UTR進而調(diào)控基因的表達,引起靶mRNA降解或蛋白翻譯的抑制。研究發(fā)現(xiàn),miRNA參與了多種生命活動,包括個體發(fā)育、細胞凋亡、增殖和代謝等。miRNA的表達具有組織特異性；在多腫瘤組織中往往表達失調(diào),與包括卵巢癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、耐藥等病理進程密切相關(guān),對腫瘤的診斷、治療和判斷預(yù)后有重要的指導(dǎo)意義。約有半數(shù)的miRNA基因位于腫瘤相關(guān)的基因組區(qū)或脆性位點,通過調(diào)控體內(nèi)相應(yīng)的癌基因或抑癌基因的表達,進而發(fā)揮重要的致癌或抑癌因子的功能。與正常卵巢組織相比,卵巢癌組織有特異的miRNA表達譜。文獻顯示miR-519d在晚期卵巢癌中表達下調(diào),但下調(diào)機制有待進一步闡明。而且,miRNA通過影響細胞凋亡或相關(guān)信號通路參與卵巢癌化療耐藥的形成。因此,恢復(fù)失衡的miRNA的表達已經(jīng)成為一個嶄新的、有發(fā)展前景的巢癌治療的新方向。 天然藥物是人類防病治病、藥物研發(fā)的重要源泉。如卵巢癌一線化療藥物紫杉醇即為從紅豆杉屬植物中分離純化得到的一類二萜類化合物。其抗癌機制主要為促進微管聚合、穩(wěn)定微管,阻斷正常的有絲分裂,發(fā)揮治療卵巢癌的作用。大多數(shù)卵巢癌患者治療效果較好,但20%以上的患者對紫杉醇耐藥。因此,新型的天然抗腫瘤藥物的尋找又成為熱點。雙聯(lián)芐類化合物是從苔蘚類植物中提取并分離得到的一類大環(huán)多酚類化合物,具廣泛的生物學(xué)活性,如抗炎、抗細菌、抗真菌、抗腫瘤等,是一類發(fā)展前景良好的抗癌新藥。Dihydroptychantol (DHA)是雙聯(lián)芐化合物的一種,本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),其在多種腫瘤細胞株中可顯著抑制細胞增殖、促進細胞凋亡；DHA還可誘導(dǎo)其他類型的細胞死亡,如自噬性死亡。然而,雙聯(lián)芐化合物的抗卵巢癌活性未有報道,其具體作用機制有待于進一步研究。 第一部分：miR-519d通過靶向調(diào)控XIAP抑制卵巢癌細胞增殖及增強順鉑敏感性的研究 研究目的： 檢測miR-519d在卵巢癌細胞系和組織中的表達,探討其對卵巢癌細胞增殖的影響和與順鉑敏感性的關(guān)系。通過預(yù)測并驗證miR-519d靶基因,揭示miR-519d的作用機制。 材料方法： 應(yīng)用TaqMan探針法檢測卵巢癌細胞系(OVCAR3、SKOV3及A2780)上皮性卵巢癌組織及正常卵巢組織的miR-519d的表達。轉(zhuǎn)染miR-519d mimics或inhibitors實現(xiàn)miR-519d在卵巢癌細胞的上調(diào)或下調(diào),采用MTT法檢測對卵巢癌細胞的增殖能力,流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率,western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白表達。生物信息學(xué)預(yù)測miR-519d的靶基因,構(gòu)建雙熒光報告基因系統(tǒng)驗證miR-519d與靶基因XIAP的關(guān)系。 實驗結(jié)果： 1. miR-519d在卵巢癌細胞系及卵巢癌組織中的表達情況 應(yīng)用TaqMan探針實時定量PCR(qRT-PCR)法檢測卵巢癌細胞系(OVCAR3、 SKOV3及A2780)及上皮性卵巢癌組織7例和正常卵巢組織2例中的1miR-519d的表達。結(jié)果顯示：卵巢癌細胞系OVCAR3、SKOV3及A2780中miR-519d的表達水平顯著低于正常卵巢組織,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.001)。上皮性卵巢癌7例組織中miR-519d的表達均較正常組織明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.001)。 2.轉(zhuǎn)染miR-519d對卵巢癌細胞增殖的影響 在A2780及SKOV3細胞中轉(zhuǎn)染miR-519d mimics及inhibitors48h后,應(yīng)用TaqMan探針qRT-PCR法檢測miR-519d的表達。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染miR-519d mimics48h后,A2780及SKOV3細胞內(nèi)的miR-519表達明顯上調(diào),分別為對照組的3985.33±400.05倍和2260.97±541.25倍。而轉(zhuǎn)染miR-519d inhibitors后,A2780及SKOV3細胞的miR-519d表達顯著被抑制,分別是對照組的0.32±0.07倍和0.08±0.02倍。在A2780及SKOV3細胞中轉(zhuǎn)染miR-519d mimics48h及72h后,應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測A2780及SKOV3細胞增殖能力。結(jié)果顯示：上調(diào)A2780細胞內(nèi)miR-519d水平后,48h及72h的A2780細胞增殖抑制率分別為：(15.50±3.62)%和(29.70±8.31)%,與對照相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P值分別為0.004及0.03)。上調(diào)SKOV3細胞內(nèi)的miR-519d水平對其增殖能力無明顯影響。 3.轉(zhuǎn)染miR-519d對卵巢癌細胞的順鉑敏感性的影響 3.1.轉(zhuǎn)染miR-519d對順鉑誘導(dǎo)的卵巢癌細胞增殖抑制作用的影響 在A2780及SKOV3細胞中轉(zhuǎn)染miR-519d mimics48h后,聯(lián)合應(yīng)用不同濃度梯度的順鉑(25,50,100μM)作用24h。應(yīng)用MTT法檢測A2780及SKOV3細胞的增殖能力,結(jié)果顯示：順鉑25μM作用于A2780細胞24h后,miR-519d轉(zhuǎn)染組與陰性對照組的細胞增殖率分別為(27.01±1.65)%和(38.18±1.48)%(P0.05)；順鉑501μM作用時,miR-519d轉(zhuǎn)染組與陰性對照組的A2780細胞增殖率分別為(19.40±1.46)%和(30.07±5.76)%(P0.05)；順鉑100μM作用時,miR-519d轉(zhuǎn)染組與陰性對照組的A2780細胞增殖率分別為(13.38±1.34)%和(20.92±2.23)%,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。轉(zhuǎn)染miR-519d的SKOV3細胞經(jīng)順鉑作用后,細胞增殖率變化趨勢與A2780細胞一致。 3.2.轉(zhuǎn)染miR-519d對順鉑誘導(dǎo)的卵巢癌細胞凋亡作用的影響 在A2780及SKOV3細胞中轉(zhuǎn)染miR-519d mimics48h后,聯(lián)合應(yīng)用不同濃度的順鉑(25,50μM)作用24h,應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測A2780及SKOV3細胞的凋亡率,結(jié)果顯示：順鉑25μM作用于A2780細胞24h后,miR-519d轉(zhuǎn)染組與陰性對照組的晚期凋亡率分別為(60.72±3.59)%和(46.82±2.38)%(P0.05)。50μM順鉑作用時,轉(zhuǎn)染1niR-519d組與陰性對照組的晚期凋亡率分別為(77.65±4.78)%和(67.26±5.35)%(P0.05)。對于SKOV3細胞,早期凋亡、晚期凋亡及壞死細胞均較對照組增加。應(yīng)用western blot法檢測A2780及SKOV3細胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達,結(jié)果顯示：順鉑50μM作用于A2780和SKOV3細胞24h后,miR-519d轉(zhuǎn)染組的酶原形式Caspase-3表達均較對照組降低,而Caspase-3及其底物PARP的剪切形式較對照組增加,表明1miR-519d加速了細胞凋亡進程。 4. miR-519d靶基因的預(yù)測及其在A2780和SKOV3細胞中的驗證 TargetScan在線預(yù)測XIAP的3’UTR有兩個miR-519d的結(jié)合位點,分別是1228-1234位點及4925-4931位點。在A2780及SKOV3細胞中轉(zhuǎn)染miR-519d mimics或inhibitors48h后,western blot法及qRT-PCR法分別檢測XIAP的蛋白及mRNA表達。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染miR-519d mimics48h后,A2780及SKOV3細胞內(nèi)XIAP的蛋白表達水平分別是對照組的0.39±0.06倍和0.62±0.06倍(P值均小于0.05)；轉(zhuǎn)染miR-519d inhibitors48h后,A2780及SKOV3細胞內(nèi)XIAP的蛋白表達水平分別是對照組的1.32±0.03倍和1.29±0.02倍(P值均小于0.05); XIAP mRNA的表達與蛋白的表達趨勢完全一致。分別構(gòu)建含有Targetscan預(yù)測的兩個結(jié)合位點的XIAP3'UTR片段的雙熒光素酶表達載體,與miR-519d共轉(zhuǎn)染SKOV3細胞48h后,檢測相對熒光素酶的表達活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：野生型XIAP3'UTR (position1228-1234)雙熒光報告基因載體組的熒光素酶相對活性明顯低于突變型XIAP3'UTR組(89.28±15.83vs.167.37±21.34),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。構(gòu)建的4925-4931位點的熒光素報告載體的實驗結(jié)果與1228-1234位點的相一致。 5. XIAP siRNA對卵巢癌細胞增殖及順鉑敏感性的影響 5.1. XIAP siRNA在A2780及SKOV3細胞中干擾作用的驗證 XIAP siRNA作用于A2780及SKOV3細胞48h后, western blot法檢測XIAP的蛋白表達,結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染XIAP siRNA的A2780及SKOV3細胞內(nèi)XIAP蛋白的表達均為陰性。 5.2. XIAP siRNA對卵巢癌細胞增殖的影響 在A2780及SKOV3細胞中轉(zhuǎn)染XIAP siRNA48h和72h后,MTT法檢測A2780及SKOV3細胞增殖能力,結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染XIAP siRNA48h和72h后的A2780細胞增殖抑制率分別為(18.53±7.75)%和(24.84±3.70)%,與對照相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；XIAP siRNA對SKOV3細胞的增殖能力無明顯影響(P0.05)。 5.3. XIAP siRNA對順鉑誘導(dǎo)的卵巢癌細胞凋亡作用的影響 在A2780及SKOV3細胞中轉(zhuǎn)染XIAP siRNA48h后,聯(lián)合應(yīng)用不同濃度的順鉑作用24h,應(yīng)用MTT法檢測卵巢癌A2780及SKOV3細胞的增殖能力,結(jié)果顯示：順鉑50μM作用于A2780細胞24h后,XIAP siRNA干擾組與陰性對照組的A2780細胞增殖率分別為(37.75±1.95)%和(49.57±2.26)%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；順鉑100μM作用時,XIAP siRNA干擾組與陰性對照組的A2780細胞增殖率分別(16.52±5.29)為和(31.02±1.0)%,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。轉(zhuǎn)染XIAP siRNA的SKOV3細胞經(jīng)順鉑作用后,細胞增殖率變化趨勢與A2780細胞一致。 在A2780及SKOV3細胞中轉(zhuǎn)染XIAP siRNA48h后,聯(lián)合應(yīng)用不同濃度的順鉑作用24h,應(yīng)用western blot法檢測A2780和SKOV3細胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達,結(jié)果顯示：順鉑50μM作用于A2780和SKoV3細胞24h后, XIAP siRNA干擾組的Caspase-3及其底物PARP的剪切形式增加。 6.卵巢癌細胞及組織中XIAP的表達情況 應(yīng)用TaqMan探針qRT-PCR法檢測OVCAR3、SKOV3及A2780細胞內(nèi)的miR-519d的表達情況,結(jié)果以2-ΔCT×103值表示,分別為1.572±0.033,1.474±0.026及0.299±0.007。應(yīng)用qRT-PCR法及western blot法分別檢測三株卵巢癌細胞系XIAP mRNA和蛋白水平的表達,結(jié)果顯示：XIAP mRNA定量結(jié)果以2-ΔcT×103值表示分別為0.003±0.002,47.62±2.33及49.68±21.32,XIAP蛋白水平的表達趨勢與mRNA水平完全一致,表明XIAP的表達與miR-519d表達呈負相關(guān)。應(yīng)用western blot法檢測7例上皮性卵巢癌組織與2例正常卵巢組織XIAP蛋白的表達,結(jié)果顯示：卵巢癌組織中XIAP蛋白表達水平與正常卵巢組織相比均顯著上調(diào),與miR-519d表達呈負相關(guān)。 結(jié)論： 1. miR-519d抑制卵巢癌SKOV3及A2780細胞增殖,增強其對順鉑作用的敏感性。 2. miR-519d通過調(diào)控XIAP表達發(fā)揮抑癌基因功能。 第二部分雙聯(lián)芐化合物DHA2通過調(diào)控XIAP及AKT/mTOR信-號-通路抑制卵巢癌作用機制的研究 研究目的： 檢測DHA2對卵巢癌細胞凋亡和自噬的影響,探討其作用機制,動物實驗驗證DHA2的抑瘤效果。 材料方法： DHA2作用于卵巢癌細胞后,MTT法檢測卵巢癌細胞的增殖能力,western blot檢測細胞中凋亡、自噬相關(guān)蛋白及AKT/mTOR通路蛋白的表達變化,PI/Annexin V雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡率,PI染色流式細胞儀檢測細胞死亡率,吖啶橙染色流式細胞儀檢測AVOs的形成,免疫熒光染色檢測細胞中LC3的表達,針對XIAP基因,設(shè)計并構(gòu)建XIAP真核表達質(zhì)粒,HE染色及免疫組化染色檢測裸鼠移植瘤的凋亡、自噬及增殖相關(guān)蛋白的表達變化。 實驗結(jié)果： 1.DHA及DHA1-3活性的細胞系篩選及其對卵巢癌細胞的生長抑制作用 應(yīng)用不同濃度的DHA及DHA1-3處理四種卵巢癌細胞系24h后,MTT法檢測四種卵巢癌細胞系的增殖。結(jié)果顯示：DHA及其衍生物DHA1-3對卵巢癌細胞系SKOV3、A2780、3A0和OVCAR3均有不同程度的增殖抑制作用,且呈劑量依賴性。DHA2對SKOV3,3AO和A2780細胞增殖的IC50值分別為13.44±0.84μmol/L,4.04±0.33μmol/L和19.80±1.08μmol/L, DHA2對正常視網(wǎng)膜上皮細胞RPE1細胞則毒性很小,IC50值為471.72±94.02μmol/L。 2.DHA2誘導(dǎo)卵巢癌SKOV3細胞死亡的機制研究 2.1DHA2對卵巢癌SKOV3細胞形態(tài)學(xué)的影響 不同濃度的DHA2作用于SKOV3細胞24h后,鏡下觀察細胞形態(tài)變化,結(jié)果顯示：在DHA25μM作用時,細胞體積略增加,細胞質(zhì)密度增加；在DHA2作用時,細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)大小不等的空泡,細胞邊緣不規(guī)則；在DHA215μM時,細胞變圓,皺縮,與鄰近細胞脫離。 2.2DHA2對卵巢癌SKOV3細胞死亡的影響 不同濃度的DHA2作用于SKOV3細胞24h后,應(yīng)用流式細胞儀檢測SKOV3細胞凋亡率,結(jié)果顯示：DHA25μM,10μM和15μM誘導(dǎo)的SKOV3的細胞死亡率分別為25.01%,56.03%和58.44%。通過測定LDH的泄漏率來評價細胞損傷的程度,結(jié)果顯示：細胞內(nèi)的LDH釋放呈劑量依賴性增加,DHA215μM處理時,LDH的泄漏率較對照增加4倍左右(904±97vs.238±12,P0.01)。應(yīng)用廣譜Caspase家族抑制劑z-VAD-fmk(20μM)或壞死性凋亡抑制劑necrostatin-1(30μM)預(yù)處理細胞2h后,加入12.5μM DHA2繼續(xù)作用12h,流式細胞術(shù)檢測SKOV3細胞死亡率。結(jié)果顯示：廣譜Caspase抑制劑z-VAD-fmk對DHA2誘導(dǎo)的SKOV3細胞死亡無顯著逆轉(zhuǎn)作用(18.75±4.28%vs.14.04±2.74%)(P0.05)。應(yīng)用壞死抑制劑necrostatin-1對DHA2誘導(dǎo)的SKOV3細胞死亡亦無明顯作用(23.18±1.86%vs.24.04±3.79%)(P0.05)。 2.3DHA2對卵巢癌SKOV3細胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白表達的影響 不同濃度的DHA2(5,10,15pM)作用于SKOV3細胞24h后,western blot方法檢測SKOV3細胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達情況。結(jié)果顯示：DHA2誘導(dǎo)的死亡伴隨著抗凋亡蛋白XIAP、Bcl-2的下調(diào),促凋亡蛋白Bax的上調(diào),Bcl-2/Bax比值下調(diào),呈時間和劑量依賴性；Caspase的底物PARP的剪切形式在SKOV3細胞中無明顯增加。 2.4. XIAP在DHA2誘導(dǎo)的SKOV3細胞死亡的作用 構(gòu)建XIAP過表達載體,在SKOV3細胞中轉(zhuǎn)染XIAP過表達載體24h后,繼續(xù)應(yīng)用12.5μMDHA2處理12h,應(yīng)用流式細胞儀檢測SKOV3細胞死亡率,結(jié)果顯示：過表達XIAP幾乎可完全逆轉(zhuǎn)DHA2誘導(dǎo)的SKOV3細胞死亡(31.87±3.53%vs.7.44±4.37%)(P0.05)。設(shè)計XIAP siRNA,轉(zhuǎn)染SKOV3細胞48h后,繼續(xù)應(yīng)用12.5μM DHA2處理12h,應(yīng)用流式細胞儀檢測SKOV3細胞死亡率。結(jié)果顯示：干擾XIAP表達能顯著增加卵巢癌細胞對DHA2的敏感性(20.41±6.98%vs.33.79±5.02%)(P0.05)。 3.DHA2對卵巢癌SKOV3細胞自噬的影響 3.1.DHA2對卵巢癌SKOV3細胞自噬溶酶體的作用 DHA212.5μM處理SKOV3細胞12h和24h,應(yīng)用AO染色流式細胞術(shù)檢測處理后SKOV3細胞內(nèi)的酸性自噬溶酶體空泡(AVOs)的形成。結(jié)果顯示：隨著DHA2作用時間的延長,AO染色的熒光強度明顯向右偏移,提示DHA2誘導(dǎo)細胞自噬體的形成。 3.2.DHA2對SKOV3細胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白的表達影響 DHA212.5μM處理SKOV3細胞不同時間后,應(yīng)用免疫熒光染色檢測LC3蛋白的表達。結(jié)果顯示：DHA2處理的SKOV3細胞自6h開始于胞漿內(nèi)逐漸出現(xiàn)紅色熒光斑點,隨著作用時間的延長,熒光斑點數(shù)量明顯增加,熒光強度也隨之增強。不同濃度的DHA2(5,10,15μM)作用于SKOV3細胞24h,或者]2.5μMDHA2作用于SKOV3細胞不同時間后,應(yīng)用western blot法檢測SKOV3細胞中自噬相關(guān)蛋白的表達,結(jié)果顯示：DHA2在卵巢癌SKOV3細胞中以劑量依賴性及濃度依賴性的方式誘導(dǎo)LC3-II的表達上調(diào),同時促進了LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化；自噬降解底物p62表達隨著藥物作用時間的增加逐漸降低；其他自噬相關(guān)蛋白如ATG5、Beclinl的表達變化不明顯。qRT-PCR法檢測自噬相關(guān)基因的mRNA的表達水平,結(jié)果顯示：經(jīng)DHA2作用后,自噬相關(guān)基因Atg5、Atg7、Atg12、 Beclinl等的mRNA表達無明顯變化。 3.3.自噬抑制劑對DI-IA2誘導(dǎo)的SKOV3細胞死亡的影響 應(yīng)用自噬抑制劑(E64D/Pepstatin A或氯喹)預(yù)處理SKOV3細胞2h后,再應(yīng)用DHA212.5μM處理SKOV3細胞12h,流式細胞術(shù)檢測SKOV3細胞死亡率。結(jié)果顯示：E64D/Pepstatin A聯(lián)合DHA2作用比DHA2單獨作用時細胞死亡率明顯增加(40.06±7.84%vs.27.93±2.31%,P0.05)；應(yīng)用氯喹阻斷自噬后也明顯增強DHA2介導(dǎo)的細胞死亡(40.06±7.84%vs.27.93±2.31%,P0.05)。在SKOV3細胞中轉(zhuǎn)染ATG5siRNA48h后,再應(yīng)用DHA212.5μM處理12h,流式細胞術(shù)檢測SKOV3細胞死亡率。結(jié)果顯示：應(yīng)用ATG5siRNA能有效阻斷LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化,并增強DHA2誘導(dǎo)的細胞死亡。 4.DHA2誘導(dǎo)卵巢癌SKOV3細胞自噬的機制研究 4.1.DHA2對AKT/mTOR信號通路的影響 不同濃度的DHA2(5,10,15μM)作用于SKOV3細胞24h,或者12.5pM DHA2作用于SKOV3細胞不同時間后,western blot方法檢測細胞中AKT/mTOR通路中相關(guān)蛋白的表達情況。結(jié)果顯示：15μM DHA2可明顯抑制p-AKT.p-mTOR的活性,而對AKT和mTOR總蛋白的表達沒有明顯影響。在作用時間上,DHA2作用3h即可引起p-AKT的明顯下調(diào),隨作用時間的延長,p-AKT的活性持續(xù)下調(diào)。對于p-mTOR, DHA2作用9h也出現(xiàn)顯著下調(diào)。 4.2. XIAP對DHA2誘導(dǎo)的SKOV3細胞自噬的影響 XIAP siRNA處理SKOV3細胞48h后,應(yīng)用12.5μMDHA2繼續(xù)作用12h,應(yīng)用western blot法檢測SKOV3細胞中相關(guān)蛋白表達情況。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染XIAP siRNA的SKOV3細胞中,LC3-II/-I值為陰性對照組的1.6倍。DHA2單獨作用的LC3-Ⅱ/-Ⅰ值為8.83,而敲除XIAP后使DHA2引起的LC3-Ⅱ/-Ⅰ值上調(diào)至12.24。 4.3.AKT在DHA2誘導(dǎo)的SKOV3細胞死亡與自噬中的作用 在SKOV3細胞中轉(zhuǎn)染AKTl-Myr載體48h后,應(yīng)用12.5μM DHA2繼續(xù)作用12h, western blot檢測SKOV3細胞中相關(guān)蛋白表達,流式細胞術(shù)檢測SKOV3細胞死亡率。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染AKT1-Myr載體48h后,p-AKT的水平明顯上調(diào),并伴隨著LC3-II的表達下調(diào),而且能部分逆轉(zhuǎn)DHA2引起的細胞死亡(31.47±2.68%vs.12.34±3.05%,P0.01)。 應(yīng)用PI3K抑制劑LY294002預(yù)處理SKOV3細胞2h后,應(yīng)用12.5μMDHA2繼續(xù)作用12h, western blot檢測SKOV3細胞中相關(guān)蛋白表達,流式細胞術(shù)檢測SKOV3細胞死亡率。結(jié)果顯示：LY294002可顯著降低p-AKT的活性,增加LC3-II的積累,并顯著增強DHA2誘導(dǎo)的細胞死亡(17.53±2.62%vs.32.26±2.04%,P0.01)。 5.DHA2對SKOV3卵巢癌裸鼠移植瘤的影響 5.1.DI-IA2對SKOV3卵巢癌裸鼠移植瘤的生長抑制作用 建立卵巢癌SKOV3細胞荷瘤裸鼠動物模型,建模成功后隨機分為對照組、DHA2低濃度組(15mg/kg)和DHA2高濃度組(30mg/kg),隔日腹腔用藥,連續(xù)兩周。結(jié)果顯示：低劑量和高劑量DHA2均顯著地抑制腫瘤的生長,瘤塊體積和瘤重的減少較對照組有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。根據(jù)不同時間點的腫瘤體積繪制腫瘤的生長曲線,結(jié)果顯示：DHA2給藥組能顯著地抑制腫瘤生長；隨著給藥時間的延長,抑瘤效果更加明顯。低劑量組和高劑量組的腫瘤體積抑制率分別為48.76%和41.79%,兩劑量組間無統(tǒng)計學(xué)差異。應(yīng)用western blot方法檢測了各組腫瘤組織中凋亡相關(guān)及自噬相關(guān)蛋白的表達,結(jié)果顯示：DHA2給藥組的腫瘤組織中XIAP的表達低于對照組,p-AKT、p-mTOR及LC3的表達變化與細胞實驗完全一致。 采用HE染色法對腫瘤組織進行形態(tài)學(xué)特征的觀察,結(jié)果顯示：DHA2抑制了腫瘤細胞的分化,并伴隨著局部腫瘤組織的壞死。應(yīng)用免疫組化檢測Ki67的表達情況,結(jié)果顯示：三組的Ki67比率分別為對照組(55.62±22.92)%,低劑量組(1.31±11.14)%,高劑量組(5.4±7.81)%,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01vs.對照組)。免疫組化結(jié)果顯示：DHA2給藥組中XIAP、p-AKT和p-mTOR表達較對照組降低,而LC3表達高于對照組。 5.2.DHA2對移植瘤模型的骨髓抑制作用及肝腎毒性研究 血常規(guī)結(jié)果顯示,各組間白細胞、血紅蛋白及血小板的水平無明顯差異,提示DHA2對骨髓造血功能無明顯的抑制作用。對各組的肝、脾、腎器官進行HE染色未發(fā)現(xiàn)有明顯的組織學(xué)異常改變。肝腎功能血液學(xué)結(jié)果顯示,高劑量組中的谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平較對照組和低劑量組有所升高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；各組間的血清肌酐(SCr)水平無明顯差異,而高劑量組中的尿素氮(BUN)水平比對照組和低劑量組有所升高(P0.05)。 結(jié)論： 1.DHA2在卵巢癌中具有生長抑制作用。 2.AKT在DH_A2誘導(dǎo)的SKOV3細胞死亡中發(fā)揮重要調(diào)控作用。 3.DHA2有可能成為治療卵巢癌的新型天然藥物。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R737.31

【參考文獻】

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1 陳為;彭萍;;X染色體連鎖的凋亡抑制蛋白和Caspase-3在上皮性卵巢癌中的表達及其臨床意義[J];細胞與分子免疫學(xué)雜志;2010年07期

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本文編號：2415566