【摘要】：研究背景 卵巢癌是嚴重威脅婦女健康的惡性腫瘤之一，由于缺乏有效的早期診斷方法，死亡率仍然位于女性生殖器惡性腫瘤之首[1]，75%的患者確診時已到晚期，五年生存率僅為30%-40%[2]。目前對卵巢癌治療的標準方案是在腫瘤細胞減滅術的基礎上施以紫杉醇與鉑類藥物為主的聯(lián)合化療，然而隨著耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)，常常使治療無效，已成為嚴重威脅女性生命的最大疾患。因此，卵巢癌的預防和治療已成為婦科腫瘤研究的最重要課題之一。 FoxM1為Forkhead轉錄因子家族重要的成員之一，是與癌癥發(fā)生、發(fā)展密切相關重要的轉錄因子。它由10個外顯子構成，且定位在約20kb的染色體端粒位置12p13-3。FoxM1具有三種剪接異構體，即FoxM1A，B和C，其中FoxM1B和C在癌組織中高表達，在正常細胞和組織中低表達[3-5]，發(fā)揮轉錄激活、促癌發(fā)生和發(fā)展的作用，而FoxM1A在癌組織中低表達，發(fā)揮轉錄抑制功能。作為一個轉錄因子，其主要功能為通過轉錄激活細胞周期調(diào)控蛋白，加快腫瘤細胞周期進程；轉錄激活VEGF，促進腫瘤血管的生成；轉錄激活MMP2、MMP9，促進腫瘤的侵襲與轉移。另外，大量的生物芯片研究表明FoxM1與卵巢癌密切相關[6]。因此，F(xiàn)oxM1是一個重要的腫瘤標志物，對于卵巢癌診斷及治療都具有重要意義。 在真核生物基因表達調(diào)控中，轉錄水平的調(diào)控是最重要的環(huán)節(jié)，它是通過特定的轉錄因子與靶基因的調(diào)控序列及其啟動子的特異性結合才能有效的調(diào)控基因的轉錄。但是到目前還沒有關于轉錄因子與FoxM1基因核心啟動子區(qū)特異性結合并能夠有效地調(diào)控其轉錄活性的相關報道。因此，通過對FoxM1基因啟動子的克隆，研究其表達調(diào)控的機制，為闡明FoxM1基因的生物學功能及與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的關系提供了理論基礎。 目前普遍認為，基因組DNA異常甲基化與腫瘤的發(fā)生密切相關，CpG島的局部甲基化是惡性腫瘤中存在的普遍現(xiàn)象，它往往早于明顯的惡性表型出現(xiàn)。大量的研究證明了DNA甲基化可影響轉錄因子結合到含有CpG島的識別序列，從而調(diào)控基因的表達。因此，研究FoxM1啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)與卵巢癌的相關性，以及探討DNA甲基化對FoxM1轉錄調(diào)控的影響，對于理解卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展的分子機制具有重要的意義，為卵巢癌的早期診斷及靶向治療提供新的思路。 目的 1.明確FoxM1在卵巢癌細胞及卵巢癌組織中的表達； 2.明確FoxM1核心啟動子區(qū)域； 3.初步探討轉錄因子Sp1對FoxM1基因的轉錄調(diào)控作用； 4.確定在卵巢癌中，DNA甲基化修飾與FoxM1表達調(diào)控的關系，，評價FoxM1在卵巢癌的早期診斷和治療中應用的可行性。 內(nèi)容及方法 1.檢測FoxM1在卵巢癌細胞系及卵巢癌組組織中的表達 1）我們用實時熒光定量PCR和Western blot技術分別檢測了FoxM1在卵巢癌細胞系（HO-8910PM、HO-8910、A2780和CP70）中的表達水平。 2）同時我們運用實時熒光定量PCR和免疫組化技術分別檢測了35例上皮性卵巢癌組織、40例正常卵巢組織的表達情況。 2.確定FoxM1核心啟動子區(qū)域 我們以正常人外周血基因組DNA為模板，用PCR技術分別擴增構建了6個長度不同但相互重疊的FoxM1基因啟動子報告基因系列截短載體,通過瞬時轉染293T細胞，運用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)確定FoxM1基因核心啟動子區(qū)域。 3.明確轉錄因子Sp1對FoxM1基因的轉錄調(diào)控作用 我們用Sp1基因真核表達質(zhì)粒和報告基因質(zhì)粒共同分別轉染卵巢癌細胞（順鉑敏感細胞系A2780和順鉑耐藥細胞系CP70），對照組轉染pcDNA3.0空載體，運用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測Sp1對FoxM1基因轉錄激活作用。 4. DNA甲基化修飾與FoxM1基因表達調(diào)控的關系 我們運用CpG島搜索軟件CpGPLOT分析了FoxM1的啟動子序列，然后，我們用亞硫酸鹽克隆測序法檢測了卵巢癌高轉移細胞系HO-8910PM，低轉移細胞系HO-8910，順鉑敏感細胞系A2780和順鉑耐藥細胞系CP70的中FoxM1核心啟動子區(qū)甲基化狀況；同時我們又運用焦磷酸測序技術分別對15例上皮性卵巢癌組織、14例正常卵巢組織中FoxM1核心啟動子區(qū)甲基化情況進行了檢測。 結果 1.實時熒光定量PCR和Western blot結果顯示FoxM1在卵巢癌細胞系（HO-8910PM、HO-8910、A2780和CP70）中均高表達；同時實時熒光定量PCR和免疫組化結果顯示FoxM1在卵巢癌組織中的表達水平（30/35=86%）顯著高于正常卵巢組織（6/40=15%，P 0.01），有統(tǒng)計學意義，而且這種高表達在轉錄水平和翻譯水平上是一致的。 2.雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示，F(xiàn)oxM1核心啟動子區(qū)位于其轉錄起始點上游+1～-95bp這段序列中。 3.熒光素酶報告基因系統(tǒng)實驗結果顯示，Sp1結合到FoxM1核心啟動子區(qū)并對其有轉錄激活作用。 4.亞硫酸鹽克隆測序法檢測結果顯示，卵巢癌高轉移細胞系HO-8910PM，低轉移細胞系HO-8910，順鉑敏感細胞系A2780和順鉑耐藥細胞系CP70四株細胞系中FoxM1核心啟動子區(qū)的甲基化程度均很低。另外，用焦磷酸測序技術檢測結果顯示，15例上皮性卵巢癌組織、14例正常卵巢組織中FoxM1核心啟動子區(qū)均存在著一定程度的低甲基化，且二者之間沒有明顯的差異（P0.05），沒有統(tǒng)計學意義，與其在卵巢癌細胞系中的甲基化程度基本一致。這些結果說明，在卵巢癌中DNA甲基化修飾可能不參與FoxM1的表達調(diào)控。 結論 1. FoxM1在正常卵巢組織中低表達或者不表達，而在四株卵巢癌細胞系和上皮性卵巢癌組織中的均高表達，并且這種高表達在轉錄水平和翻譯水平上是基因一致的，提示FoxM1基因與卵巢癌的發(fā)生密切相關。 2.首次確定了FoxM1核心啟動子區(qū)位于其轉錄起始點上游+1bp～-95bp這段序列中，為進一步研究FoxM1與腫瘤關系的分子機制奠定了基礎。 3.確定了Sp1上調(diào)FoxM1基因的轉錄表達，使我們能夠期望解釋為什么FoxM基因在卵巢癌中高表達以及在侵襲、轉移中的作用機制。 4.確定了卵巢癌細胞、卵巢癌組織和正常卵巢組織中FoxM1核心啟動子區(qū)均存在著一定程度的低甲基化，但三者甲基化程度基本一致，沒有統(tǒng)計學意義，提示在卵巢癌中DNA甲基化修飾可能不參與FoxM1的表達調(diào)控。
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【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R737.31

【引證文獻】

相關碩士學位論文 前1條

1 封彥青;Shh和Foxm1在膽囊癌中的表達和臨床意義及其與腫瘤的關系[D];南昌大學醫(yī)學院;2015年

本文編號：2347609