【摘要】：自然狀態(tài)(非人為目的)發(fā)生的流產(chǎn)稱(chēng)為自然流產(chǎn)。在所有臨床確認(rèn)的妊娠中,自然流產(chǎn)的發(fā)生率大約為15%。早期流產(chǎn)是指發(fā)生在12周以前的流產(chǎn),而妊娠12周至不足28周的流產(chǎn)定義為晚期流產(chǎn)。microRNAs (miRNAs)是一種內(nèi)源性非編碼小RNA,以完全或非完全互補(bǔ)的方式與其靶mRNA相結(jié)合,通過(guò)影響靶基因轉(zhuǎn)錄或翻譯來(lái)調(diào)控細(xì)胞發(fā)育、分化、增殖、凋亡及疾病的發(fā)生發(fā)展等。研究表明,在正常妊娠胎盤(pán)、絨毛和正常子宮內(nèi)膜中,一些miRNA差異表達(dá),并與相關(guān)基因存在一定的靶向作用,提示自然流產(chǎn)的發(fā)生可能與miRNA的表達(dá)有一定的關(guān)系。但以往研究檢測(cè)的miRNA數(shù)量有限,有關(guān)miRNA在人自然流產(chǎn)和早孕蛻膜中具體表達(dá)豐度報(bào)道較少。因此深入研究miRN A在自然流產(chǎn)和早孕蛻膜中的表達(dá)和功能,可以為研究自然流產(chǎn)的發(fā)病機(jī)理提供新的線索。研究目的：1.分析miRNA在自然流產(chǎn)和早孕蛻膜中的表達(dá)差異,篩選并驗(yàn)證表達(dá)差異顯著的1niRNA,進(jìn)一步預(yù)測(cè)候選miRNA對(duì)應(yīng)的靶基因：2.檢測(cè)候選靶基因在流產(chǎn)及早孕蛻膜中的表達(dá)及意義；3.體外驗(yàn)證miRNA-199b-5p 和 SGK1在維持妊娠中的靶向關(guān)系和作用；4.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)miRNA-199b-5p在妊娠維持中可能的調(diào)控作用,探討mi] RNA在自然流產(chǎn)中的作用。研究方法：1.運(yùn)用miRNAs測(cè)序技術(shù),篩選在自然流產(chǎn)和早孕蛻膜中的差異表達(dá)miRNA,發(fā)現(xiàn)流產(chǎn)蛻膜中一系列上調(diào)和下調(diào)的miRNA。2. microRNA檢測(cè)和鑒定：選取10 個(gè) miRNA,利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR (Real-time PCR)驗(yàn)證miRNA在流產(chǎn)蛻膜(流產(chǎn)組)及早期妊娠蛻膜(早孕組)中的表達(dá)水平。3.結(jié)合以往研究中與早期妊娠維持關(guān)系密切的基因,利用預(yù)測(cè)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)明顯差異表達(dá)的microRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè),并在體內(nèi)檢測(cè)靶基因的表達(dá)。4. microRNA的功能鑒定：在體外水平過(guò)表達(dá)或敲減1niR-199b-5p,檢測(cè)靶基因表達(dá)變化,制備過(guò)表達(dá)miR-199b-5p的轉(zhuǎn)基因小鼠模型,利用RT-PCR與免疫印跡(Western blot)技術(shù)驗(yàn)證靶基因的表達(dá)水平。研究結(jié)果：1.測(cè)序比較了1921條已知miRNA并發(fā)現(xiàn)123條新miRNA,與正常早孕蛻膜相比,流產(chǎn)蛻膜有37個(gè)差異表達(dá)的miRNA,其中20個(gè)miRNA在流產(chǎn)蛻膜組織中表達(dá)升高,17個(gè)miRNA表達(dá)下降。在流產(chǎn)蛻膜三個(gè)表達(dá)量最高的miRNA 是 miR-let-7a-5p、miR-let-7f-5p和miR-let-7b-5p,分別占全部miRNA的25.63%、21.99%和17.82%。2.選取表達(dá)量前10個(gè)差異miRNA,應(yīng)用RT-PCR在流產(chǎn)蛻膜與正常早孕蛻膜中進(jìn)行驗(yàn)證,其中7個(gè)miRNA與測(cè)序結(jié)果相符：1et-7a-5p、 let-7f-5p、let-7g-5p、let-7e-5p、let-7d-5p 和 miR-98-5p在流產(chǎn)蛻膜中表達(dá)下降(P0.05)。miR-199b-5p在流產(chǎn)蛻膜中表達(dá)升高(P0.05)。3.用生物信息學(xué)方法對(duì)差異miRNA進(jìn)行分析,預(yù)測(cè)出108787個(gè)靶基因。通過(guò)靶基因評(píng)分以及靶基因功能注釋,選擇miRNAs可能對(duì)應(yīng)的蛻膜化相關(guān)的靶基因進(jìn)行功能性分析。根據(jù)靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果,選取血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)蛋白激酶1(Serum-and-glucocorticoid-regulated kinase-1, SGK-1)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅱ受體(Ⅰnsulin growth factor 2 receptor, IGF2R)、基質(zhì)金屬蛋白酶10(Matrix metalloproteinase 10, MMP10)和瘦素受體(Leptin Receptor, LEPR)和作為候選靶基因,利用RT-PCR和免疫組化技術(shù)驗(yàn)證其在流產(chǎn)蛻膜和正常早期妊娠蛻膜中的表達(dá)。SGK1、 MMP10和LEPR在流產(chǎn)蛻膜表達(dá)減低,IGF2R在流產(chǎn)蛻膜表達(dá)增加。4.將miR-199b-5p模擬物轉(zhuǎn)染293T和Ishikawa細(xì)胞,RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后SGK1 mRN A和蛋白水平降低(P0.05)。在293T和Ishikawa細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-199b-5p抑制劑后SGK1 mRNA和蛋白水平增加(P0.05),在hESC (human endometrial stromal cells)中轉(zhuǎn)染miR-199b-5p'慢病毒抑制載體后同樣發(fā)現(xiàn)SGK1 mRNA和蛋白表達(dá)升高。5.在過(guò)表達(dá)miR-199b-5p轉(zhuǎn)基因小鼠子宮組織中,SGK1 mRNA和蛋白水平降低(P0.05)。結(jié)論1.早孕蛻膜中特異表達(dá)的miRNA可能參與了子宮內(nèi)膜蛻膜化以及早期妊娠的維持。自然流產(chǎn)蛻膜組織中存在一些表達(dá)失衡的miRNA,這些異常表達(dá)的miRNA可能與自然流產(chǎn)的發(fā)生有關(guān)。2.通過(guò)對(duì)差異miRNA的GO和KEGG分析,捕獲了大量蛻膜化相關(guān)的靶基因,并分析出可能與之相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞信號(hào)通路,有望通過(guò)靶基因的研究揭示差異miRNA的調(diào)控機(jī)制。3.體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示niR-199b-5p與SGK1的表達(dá)有反向調(diào)控關(guān)系,miR-199b-5p有可能通過(guò)調(diào)控SGK1影響早期妊娠維持。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R714.21

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本文編號(hào)：2296589