發(fā)布時間：2018-10-23 16:40

【摘要】：目的人胚胎干細胞起源于囊胚內(nèi)細胞團，具有無限自我更新及體內(nèi)外分化成人體任何一種細胞類型的能力，胚胎干細胞全能性特征可為細胞替代治療及藥物篩選提供大量資源。人胚胎干細胞系1998年就已建立，但是胚胎干細胞系的發(fā)育潛能和表觀遺傳特性存在很大差異，導(dǎo)致用于人體移植治療時會出現(xiàn)HLA免疫排斥問題。國內(nèi)干細胞株數(shù)遠不能滿足HLA匹配數(shù)，還需要建大量不同胚胎來源的干細胞株。在大部分IVF胚胎室，受精卵通常培養(yǎng)至第3天（D3），所有胚胎經(jīng)形態(tài)學(xué)評分后，高評分胚胎用于移植或冷凍，低評分胚胎由于發(fā)育潛能不足，序貫培養(yǎng)獲得囊胚著床率低、死亡率及染色體異常率高，通常予以丟棄。盡管形態(tài)學(xué)評分目前是大多數(shù)生殖中心的胚胎判斷標準，但并不是胚胎發(fā)育潛能的金標準。本研究收集D3低質(zhì)量廢棄胚胎，序貫培養(yǎng)至D6，囊胚擴張后（3級及以上）行玻璃化冷凍，凍融后培養(yǎng)至D8或D9接種，本研究在常規(guī)建系方法基礎(chǔ)上進行了改進，嘗試用D6天低質(zhì)量凍融囊胚進行干細胞建系，為人廢棄胚胎干細胞建系提供材料和方法學(xué)參考。 方法（1）囊胚序貫培養(yǎng)、冷凍：本實驗開始前已獲得安徽醫(yī)科大學(xué)倫理委員會的同意，，并且所有提供廢棄胚胎的夫婦均已簽署知情同意書，同意其廢棄胚胎用于科研。收集本中心D3廢棄胚胎行序貫培養(yǎng)，獲得的囊胚玻璃化冷凍儲存。 （2）胚胎解凍、培養(yǎng)：胚胎解凍后序貫培養(yǎng)至D8或D9，觀察囊胚形態(tài)變化，對含有內(nèi)細胞團的存活囊胚進行接種。 （3）接種、傳代：接種之前鏈蛋白酶消化去除透明帶，機械打孔成功后接種，待原代集落長出后，將原代集落接種至事先準備好的小鼠飼養(yǎng)層上，7天傳代一次。 （4）胚胎干細胞特征鑒定：分別取不同代次的胚胎干細胞行堿性磷酸酶染色，干細胞體內(nèi)外分化，免疫組化熒光染色以及染色體核型分析。 結(jié)果（1）囊胚形成率：共收集168枚低形態(tài)學(xué)評分的D3廢棄胚胎，參照SteerCV的評分標準，所有胚胎的單胚胎評分均小于16分。序貫培養(yǎng)至D6天共獲得低質(zhì)量囊胚（包括3CB,3BC,4CB,4CC）32枚，復(fù)蘇后存活26枚，囊胚形成率19.0%，復(fù)蘇存活率81.3%。 （2）復(fù)蘇、接種后生長狀況：復(fù)蘇后存活的囊胚26枚，均含有不同形狀大小的內(nèi)細胞團，分離出原代克隆8個，其中2個在傳代過程中分化，其余2個原代克隆準備傳第2代時出現(xiàn)污染。我們從一個4CB及3BC的囊胚成功分離培養(yǎng)出hESC，其中1株已傳36代，另一株已傳20代。 （3）hESC的生物學(xué)特性分析：傳代過程中的干細胞集落表現(xiàn)出典型的干細胞克隆特征，細胞間連結(jié)緊密，與周圍飼養(yǎng)層細胞形成明顯的界限；堿性磷酸酶AKP染色強陽性；間接免疫熒光著色，干細胞集落高表達OCT-4抗體；完整干細胞集落免疫表型分析顯示細胞集落TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA-3、SSEA-4表達陽性。D26，D36染色體核型分析均為正常二倍體核型，46XX。干細胞集落接種到SCID小鼠腹股溝皮下，10周后形成的畸胎瘤可見3個胚層的細胞，包括角化復(fù)層扁平上皮（外胚層）、軟骨（中胚層）以及腸腺上皮（內(nèi)胚層）；胚胎干細胞克隆集落體外懸浮培養(yǎng)14天后形成擬胚體狀結(jié)構(gòu)。 結(jié)論臨床上D3低質(zhì)量胚胎經(jīng)囊胚序貫培養(yǎng)可以形成囊胚；低質(zhì)量冷凍囊胚經(jīng)復(fù)蘇培養(yǎng)接種后可以形成胚胎干細胞原代集落；低質(zhì)量冷凍來源的胚胎干細胞原代集落可以成功接種傳代并保持經(jīng)典胚胎干細胞特性；臨床上低質(zhì)量廢棄胚胎可以成功序貫培養(yǎng)出囊胚并進行胚胎干細胞建系研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R714.8

【共引文獻】

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本文編號：2289856