【摘要】：研究背景與方法胎盤是胚胎發(fā)育中最早形成的臨時性器官,又是妊娠時期最重要的內(nèi)分泌器官,一旦胎盤分泌激素不足或者紊亂,將會導(dǎo)致胎兒和母體的各種疾病。在胎盤合成的所有甾體激素中,孕酮(P4)和雌二醇(E2)是最重要的。胎盤的基本結(jié)構(gòu)和功能單位是胎盤絨毛膜絨毛,它主要由合體滋養(yǎng)層、細胞滋養(yǎng)層、絨毛膜間質(zhì)和胎兒血管內(nèi)皮組成。合體化是發(fā)生于人類胎盤中的一種細胞-細胞融合類型,是指單核的細胞滋養(yǎng)層細胞融合形成多核的合胞體滋養(yǎng)層細胞的過程,是胎盤正常形態(tài)學(xué)和胎盤功能維持的前提條件;同時,胎盤激素的分泌也和滋養(yǎng)層的合體化密切相關(guān)。Hedgehog(H)基因是一種最初在果蠅里發(fā)現(xiàn)的分節(jié)極性基因。哺乳動物中存在三個 Hedgehog 的同源基因:Sonic Hedgehog(SHH)、Indian Hedgehog(1HH)和Desert Hedgehog(DHH),分別編碼SHH、IHH和DHH蛋白。HH信號傳遞受靶細胞膜上兩種受體Patched(PTC)和Smoothened(SMO)的控制。正常情況下,PTC抑制SMO蛋白的活性,從而抑制下游通路,這時下游的GLI蛋白在蛋白酶體(Proteasome)內(nèi)被截斷,并以羧基端被截斷的形式(GLI-AC)進入細胞核內(nèi),抑制下游靶基因的轉(zhuǎn)錄;而當(dāng)PTC和HH結(jié)合以后,PTC對SMO的抑制作用被解除,從而使全長的GLI蛋白進入細胞核內(nèi)激活下游靶基因轉(zhuǎn)錄。之前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn),HH信號中的關(guān)鍵分子在小鼠的胎盤中顯著表達,同時SHH基因的缺失造成小鼠胎盤發(fā)育缺陷,導(dǎo)致胎鼠發(fā)育障礙,這證實SHH在小鼠胎盤中發(fā)揮巨大的作用。然而,HH信號對人胎盤的效應(yīng)及其分子機制尚未知曉。本課題采用人胎盤組織和人胎盤來源的細胞系,通過免疫組織化學(xué)染色、免疫熒光染色、組織HE染色、體外胎盤滋養(yǎng)層細胞分離與培養(yǎng)、實時熒光定量PCR、WesternBlot、蛋白過表達載體瞬時轉(zhuǎn)染、蛋白質(zhì)鄰位連接試驗、蛋白質(zhì)半衰期測定試驗、酶聯(lián)免疫吸附法、慢病毒介導(dǎo)的的基因敲降、雙熒光素酶報告基因檢測、細胞融合指數(shù)的測定、蛋白質(zhì)免疫共沉淀、染色質(zhì)免疫共沉淀和裸鼠的移植瘤模型等實驗技術(shù),研究了 HH信號對人胎盤滋養(yǎng)細胞甾體激素合成和合體化的效應(yīng)及其分子機制。研究結(jié)果1.HH信號中的關(guān)鍵分子在人胎盤組織中均有表達。其中,DHH和IHH均大量表達于絨毛錐和滋養(yǎng)層細胞層,而SHH在絨毛錐和滋養(yǎng)層細胞層的表達量則較低。兩個受體蛋白PTC和SMO主要表達于滋養(yǎng)層細胞層,而轉(zhuǎn)錄因子GLI2和GLI3則均大量表達于絨毛錐和滋養(yǎng)層細胞層。但是,轉(zhuǎn)錄因子GLI1在胎盤中的表達較弱。2.激活HH信號可顯著促進人胎盤細胞滋養(yǎng)層細胞(CTB,cytotrophoblast)和JEG-3細胞中膽固醇向孕酮(P4)和雌二醇(E2)等甾體激素的轉(zhuǎn)化;并且,SHH顯著地增加參與孕酮、雌二醇合成的三個關(guān)鍵酶P450scc、3P-HSD1和aromatase的mRNA水平和蛋白水平的表達。此外,激活HH信號可顯著促進CTB和BeWo細胞的合體化,包括細胞融合指數(shù)的增加,融合基因及細胞合體化關(guān)鍵marker(syncytin-1和PP13等)的mRNA和蛋白水平的的升高,以及βHCG分泌量的增加。3.HH對甾體激素的合成及合體化的調(diào)控依賴受體蛋白SMO。抑制劑cyclopamine 劑量依賴地逆轉(zhuǎn) SHH 誘導(dǎo)的 P450scc,3β-HSD1 和 aromatase 的mRNA和蛋白表達,同時顯著地抑制了 SHH誘導(dǎo)的P4和E2的合成;相反地,過表達SMO*(SMO氨基酸突變體,SMO的連續(xù)激活形式)可顯著上調(diào)P450scc,3β-HSD1和aromatase的 mRNA和蛋白表達并顯著促進P4和E2的合成。此外,激動劑purmorphamine或SMO*均能夠顯著地抑制ZO-1的mRNA和蛋白水平的表達,而促進PHCG的合成以及syncytin-1和PP13的mRNA和蛋白水平的表達;相反地,抑制劑cyclopamine顯著增加了 ZO-1的表達,而抑制了 syncytin-1和PP13的mRNA和蛋白水平的表達,以及βHCG的合成。4.轉(zhuǎn)錄因子家族GLI蛋白在調(diào)控人胎盤滋養(yǎng)細胞甾體激素合成和合體化中發(fā)揮著不同的作用。在甾體激素合成中,GLI3調(diào)控P450scc的轉(zhuǎn)錄,而GLI2則影響3β-HSD1和aromatase的轉(zhuǎn)錄。與這幾個酶的變化相一致,GLI2和GLI3調(diào)控P4的合成,而GLI2則調(diào)控E2的合成。在合體化中,GLI2對于HH調(diào)控的合體化是必需的。GLI2能夠調(diào)控ZO-1的mRNA和蛋白水平的表達,βHCG的合成以及syncytin-1和PP13的mRNA和蛋白水平的表達。前人的研究表明,GCMa在調(diào)控滋養(yǎng)層細胞合體化中發(fā)揮著不可或缺的作用;并且許多細胞融合基因(如syncytin-1)為GCMa的靶基因,GCMa可以通過促進融合基因的表達進一步促進合體化。我們發(fā)現(xiàn),GLI2能夠與GCMa形成復(fù)合體從而顯著影響GCMa蛋白的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性;此外,轉(zhuǎn)錄復(fù)合體GLI2-GCMa對于滋養(yǎng)層細胞的合體化是必需的。5.發(fā)現(xiàn)GLI新的靶基因。雙熒光素酶報道基因?qū)嶒炞C實GLI2顯著地促進3β-HSD1、aromatase和syncytin-1的啟動子報道基因的活性,過表達△N-GLI3能夠顯著地促進P4500scc啟動子報道基因的活性。染色質(zhì)免疫共沉淀-PCR實驗進一步證實,GLI2能夠與3β-HSD1、aromatase和syncytin-1基因的啟動子結(jié)合,而GLI3則能夠與P450scc的啟動子結(jié)合。6.裸鼠移植瘤模型中的結(jié)果。為了進一步明確HH調(diào)控的P4和E2的生理作用,我們在卵巢切除的裸鼠中植入了人胎盤滋養(yǎng)層絨毛膜癌細胞JEG-3來源的移植瘤,同時cyclopamine給藥。結(jié)果表明,移植了 JEG-3瘤的卵巢切除裸鼠子宮增大,子宮上皮平坦但明顯增厚,子宮內(nèi)膜腺體以及蛻膜了的基質(zhì)細胞增多,提示子宮的蛻膜化程度較高。低劑量的cyclopamine和高劑量的cyclopamine均不影響腫瘤的體積和重量,也沒有顯著影響腫瘤細胞的增殖和凋亡。但是,cyclopamine劑量依賴地顯著抑制了小鼠血清中P4和E2水平,同時,cyclopamine顯著降低了子宮濕重,抑制了子宮上皮的增厚,減少了基質(zhì)細胞的數(shù)量以及子宮內(nèi)膜腺體的數(shù)量。因此,以上結(jié)果證實,HH信號的抑制引起了 P4和E2的合成減少,導(dǎo)致子宮蛻膜化顯著減弱。結(jié)論我們的研究結(jié)果表明,在人胎盤組織中,HH信號通路的關(guān)鍵分子均有表達。HH通過不同的GLI轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控妊娠時期的不同事件:GLI2和GLI3分別通過促進甾體激素合成酶3β-HSD1和aromatase,以及P450scc的轉(zhuǎn)錄從而誘導(dǎo)膽固醇向雌二醇、孕酮的轉(zhuǎn)變。此外,在滋養(yǎng)層細胞的合體化過程中,GLI2通過與轉(zhuǎn)錄因子GCMa結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄異源二聚體,從而增強了 GCMa的蛋白穩(wěn)定性與活性,同時轉(zhuǎn)錄復(fù)合體GLI2-GCMa通過促進融合基因syncytin-1等的轉(zhuǎn)錄進一步促進細胞滋養(yǎng)層細胞的合體化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R714.5

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本文編號：2280108