【摘要】：研究背景和目的隨著生育年齡的推后,環(huán)境污染和生活壓力增大,不孕癥的發(fā)生率呈現(xiàn)一個上升的趨勢。近年來,體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)及其相關的衍生技術快速發(fā)展及其在臨床的廣泛應用使得眾多不孕不育患者有機會獲得了后代。IVF-ET成功的關鍵環(huán)節(jié)就是胚胎的成功著床。輔助生殖中總體妊娠率徘徊在40%-60%[1]左右,但是不少夫婦反復多次助孕后仍然失敗,經(jīng)濟和精神都受到巨大的壓力,臨床醫(yī)生也沮喪不已。2005年從Thomhill提出反復著床失敗(repeated implantation failure,RIF)[2]的定義到后來 Margaliothle等學者提出還需考慮胚胎期別和患者年齡[3],至今大多數(shù)學者采用的RIF定義是:移植3次以上優(yōu)質(zhì)胚胎或者多次移植胚胎數(shù)量共計≥ 10枚后仍未能獲得臨床妊娠。RIF已經(jīng)成為輔助生殖中提高妊娠率的瓶頸問題,如何改善這類不孕患者的助孕結(jié)局,提高胚胎著床的成功率成為了我們亟待解決的問題。南方醫(yī)院生殖中心體外受精-胚胎移植的反復著床失敗的發(fā)生率約為7～11%[4],全松等認為原因有如下幾個方面:胚胎質(zhì)量不良、移植技術缺陷、子宮內(nèi)膜容受性不良、精神心理因素及不明原因。其中約2/3的反復著床失敗是由于子宮內(nèi)膜容受性不良導致的[5,6]。因此,研究改善如何圍著床期子宮內(nèi)膜的容受性及其相關機制,成為了反復著床失敗的研究熱點,對于提高RIF助孕患者的妊娠率具有重要的意義。人類育齡期婦女的生殖系統(tǒng)存在生理性血管生成,對生殖系統(tǒng)的生長發(fā)育和基本功能的至關重要[7,8],而既往對子宮內(nèi)膜組織學的研究發(fā)現(xiàn),圍著床期過程中子宮內(nèi)膜局部生理性血管新生活動處于高峰是圍著床期生殖系統(tǒng)發(fā)生的最顯著性標志之一。巨噬細胞是一種古老的免疫細胞,在固有免疫和適應性免疫反應中都起著關鍵性的作用,是炎性反應中主要的調(diào)節(jié)細胞[9]。巨噬細胞功能廣泛,有經(jīng)典免疫學中的吞噬作用、抗原提呈作用以及殺菌作用,還能分泌多種細胞因子在不用的組織內(nèi)環(huán)境產(chǎn)生不同的作用[10-12]。近年來,有學者發(fā)現(xiàn),巨噬細胞除了經(jīng)典的免疫功能外,還有著一些新的功能例如促進血管形成和血管重建等[13],提示巨噬細胞也可能參與胚胎著床的發(fā)生。本課題前期研究運用了大鼠NR8383巨噬細胞株進行研究表明PGE2是通過調(diào)節(jié)大鼠NR8383巨噬細胞生成VEGF,并且可能進而調(diào)控其對血管新生的活動[14]。但是人巨噬細胞的相關機制尚未見報道。本課題選取THP-1巨噬細胞及其促血管新生的作用作為切入點,通過研究THP-1巨噬細胞如何上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白表達及其調(diào)控的機制探討其相關的促血管生成作用,為RIF的臨床治療提供實驗依據(jù)。第一章PGE2上調(diào)THP-1巨噬細胞VEGF表達的機制研究第一節(jié)PGE2上調(diào)THP-1巨噬細胞VEGF表達目的:為了研究在女性生殖系統(tǒng)中發(fā)揮關鍵作用的巨噬細胞是可能通過何種機制調(diào)節(jié)促血管生成的作用,我們采用了 THP-1巨噬細胞進行了體外細胞學實驗,通過Western Blot的方法檢測THP-1巨噬細胞內(nèi)促血管生成因子VEGF蛋白表達水平,初步探討PGE2能否促進THP-1巨噬細胞合成VEGF的表達。方法:1.細胞培養(yǎng)和誘導選取生長良好的人單核細胞株THP-1細胞,PMA誘導細胞貼壁形成典型的巨噬細胞即為THP-1巨噬細胞。2.Westernblotting檢測PGE2對THP-1巨噬細胞株VEGF蛋白表達的影響。選取狀態(tài)良好的THP-1巨噬細胞,分組為:空白處理組、1μmol/LPGE2組、10μmol/LPGE2組,處理THP-1巨噬細胞24小時后,提取細胞全蛋白,Western Blot分析VEGF蛋白的表達。3.SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)處理分析,結(jié)果用均數(shù)±標準差表示,多樣本均數(shù)比較應用方差分析,方差齊選用LSD方法,方差不齊則用Duimett T3法,結(jié)果:與空白對照組相比,1μmol/LPGE2組THP-1巨噬細胞內(nèi)的VEGF蛋白表達明顯升高(P0.05);與與空白對照組相比,10μmol/LPGE2組THP-1巨噬細胞內(nèi)的VEGF蛋白表達明顯升高(P0.05);與1μmol/LPGE2組相比,10μmol/L PGE2組THP-1巨噬細胞內(nèi)的VEGF蛋白表達亦有明顯升高(P0.05)。結(jié)論:PGE2能有效上調(diào)THP-1巨噬細胞株VEGF蛋白的表達。并且,PGE2對THP-1巨噬細胞株VEGF蛋白表達的促進作用與呈濃度-梯度效應。第二節(jié)PGE2上調(diào)THP-1巨噬細胞VEGF表達的通路研究目的:采用了 PGE2的特異性受體拮抗劑(EP2拮抗劑AH6809或EP4拮抗劑AH23848)或cAMP-PKA通路的特異性抑制劑(腺苷酸環(huán)化酶抑制劑SQ22536或PKA抑制劑H89)預處理后再予PGE2刺激THP-1巨噬細胞,通過Western Blot的方法檢測THP-1巨噬細胞內(nèi)VEGF蛋白表達水平,進一步探討PGE2調(diào)控THP-1巨噬細胞合VEGF表達的機制。方法:1.細胞培養(yǎng)和誘導選取生長良好的人單核細胞株THP-1細胞,PMA誘導細胞貼壁形成典型的巨噬細胞即為THP-1巨噬細胞。2.Westemblotting檢測PGE2上調(diào)THP-1巨噬細胞株VEGF蛋白表達的通路研究。選取狀態(tài)良好的THP-1巨噬細胞,予PGE2的特異性受體拮抗劑(EP2拮抗劑AH6809或EP4拮抗劑AH23848)預處理后再予PGE2刺激THP-1巨噬細胞,提取細胞全蛋白,Western Blot分析VEGF蛋白的表達。選取狀態(tài)良好的THP-1巨噬細胞,予cAMP-PKA通路的特異性抑制劑(腺苷酸環(huán)化酶抑制劑SQ22536或PKA抑制劑H89)預處理后再予PGE2刺激THP-1巨噬細胞,提取細胞全蛋白,Western Blot分析VEGF蛋白的表達。3.SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)處理分析,結(jié)果用均數(shù)±標準差表示,多樣本均數(shù)比較應用方差分析,方差齊選用LSD方法,方差不齊則用Duimett T3法,P0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。結(jié)果:EP2拮抗劑能抑制PGE2對THP-1巨噬細胞株VEGF蛋白表達的上調(diào)作用,而EP4則無影響。腺苷酸環(huán)化酶抑制劑SQ22536和PKA抑制劑H89均能抑制PGE2對THP-1巨噬細胞株VEGF蛋白表達的上調(diào)作用。結(jié)論:PGE2是通過EP2-cAMP-PKA通路調(diào)控THP-1巨噬細胞株VEGF蛋白的表達。第二章PGE2增強THP-1巨噬細胞促進體外血管新生的影響第一節(jié)PGE2影響THP-1巨噬細胞促進HUVECs的遷移能力目的:上述實驗初步證明了 PGE2通過EP2-cAMP-PKA通路調(diào)控THP-1巨噬細胞VEGF蛋白的表達,從而提示了 PGE2可能是通過上調(diào)了 THP-1巨噬細胞株的VEGF表達從而增強其促血管生成作用。因此我們采用了體外細胞學實驗—Transwell細胞遷移實驗和Matrigel體外成管實驗,予不同處理THP-1巨噬細胞后,取細胞培養(yǎng)上清處理HUVECs,觀察HUVECs遷移的數(shù)目,驗證PGE2是否可以影響THP-1巨噬細胞促進HUVECs的遷移能力以及其影響的可能機制。方法:1.細胞培養(yǎng)和誘導選取生長良好的人單核細胞株THP-1細胞,PMA誘導細胞貼壁形成典型的巨噬細胞即為THP-1巨噬細胞。2.體外血管生成實驗檢測PGE2對THP-1巨噬細胞株促進HUVECs遷移能力的影響。選取狀態(tài)良好的THP-1巨噬細胞,分組為:空白處理組:不予任何處理1 μmol/L PGE2 組:1μmol/L PGE2 處理 THP-1 巨噬細胞 24h 10μmol/L PGE2組:10μmol/L PGE2 處理 THP-1 巨噬細胞 24hAH6809+ PGE2 組:10μmol/L AH6809 預處理 1h 后加 10μmol/L PGE2 處理THP-1巨噬細胞23hAH23848+ PGE2 組:10μmol/L AH23848 預處理 1h 后加 10μmol/L PGE2 處理THP-1巨噬細胞23hSQ22536+ PGE2 組:30μmol/L SQ22536 預處理 1h 后加 10μmol/L PGE2 處理THP-1巨噬細胞23hH89++ PGE2 組:10μmol/L H89 預處理 1h 后加 10μmol/L PGE2 處理 THP-1巨噬細胞23h上述各組處理的細胞培養(yǎng)上清棄去,PBS洗滌細胞后繼續(xù)無血清基礎培養(yǎng)基裴洋8h后取細胞培養(yǎng)上清處理HUVECs,分別以Transwell細胞遷移實驗觀察不同處理下HUVECs遷移數(shù)目差異,從而研究PGE2對THP-1巨噬細胞株促進體外血管生成的影響3.SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)處理分析,結(jié)果用均數(shù)±標準差表示,多樣本均數(shù)比較應用方差分析,方差齊選用LSD方法,方差不齊則用Duimett T3法,結(jié)果:與空白對照組相比,1μmol/LPGE2組HUVECs遷移數(shù)目增多(P0.05);與空白對照組相比,10μmol/LPGE2組HUVECs遷移數(shù)目也明顯增多(P0.05);與 1 μmol/LPGE2 組相比,10μmol/LPGE2 組 HUVECs 遷移數(shù)目增多(P0.05);AH6809+ PGE2 組的 HUVECs 遷移數(shù)目較10μmol/L PGE2 組的少(P0.05),AH23848+ PGE2的HUVECs遷移數(shù)目與10μmol/LPGE2組相比無統(tǒng)計學差異;SQ22536+ PGE2 組和 H89++ PGE2 組的 HUVECs 遷移數(shù)目與10μmol/LPGE2 組相比均減少(P0.05)。結(jié)論:1.PGE2處理THP-1巨噬細胞能增強HUVECs遷移能力。PGE2處理THP-1巨噬細胞后,能明顯增強HUVECs遷移的能力。其增強的能力與PGE2呈濃度-梯度效應,這與Westemblot的結(jié)果相一致。2.PGE2處理THP-1巨噬細胞能增強HUVECs遷移能力的機制。EP2拮抗劑AH6809、腺苷酸環(huán)化酶抑制劑SQ22536和PKA抑制劑H89均能抑制PGE2增強THP-1巨噬細胞能促進HUVECs遷移能力,提示PGE2通過EP2和cAMP-PKA通路調(diào)控THP-1巨噬細胞增強HUVECs的遷移能力。第二節(jié)PGE2影響THP-1巨噬細胞促進HUVECs的體外成管能力目的:上述實驗初步證明了 PGE2通過EP2-cAMP-PKA通路調(diào)控THP-1巨噬細胞VEGF蛋白的表達,從而提示了 PGE2可能是通過上調(diào)了 THP-1巨噬細胞株的VEGF表達從而增強其促血管生成作用。因此我們采用了 Matrigel體外成管實驗,予不同處理THP-1巨噬細胞后,取細胞培養(yǎng)上清處理HUVECs,觀察HUVECs的體外成管面積,驗證PGE2是否可以影響THP-1巨噬細胞促進HUVECs的體外成管能力以及其影響的可能機制。方法:1.細胞培養(yǎng)和誘導選取生長良好的人單核細胞株THP-1細胞,PMA誘導細胞貼壁形成典型的巨噬細胞即為THP-1巨噬細胞。2.體外血管生成實驗檢測PGE2對THP-1巨噬細胞株促進HUVECs體外成管能力的影響。選取狀態(tài)良好的THP-1巨噬細胞,分組為:空白處理組:不予任何處理11μmol/LPGE2 組:1μmol/LPGE2 處理 THP-1 巨噬細胞 24h 1 0μmol/L PGE2 組:1 0μmol/L PGE2 處理 THP-1 巨噬細胞 24hAH6809+ PGE2 組:10μmol/L AH6809 預處理 1h 后加 10μmol/L PGE2 處理THP-1巨噬細胞23hAH23848+ PGE2 組:10μmol/L AH23848 預處理 1h 后加 10μmol/L PGE2 處理THP-1巨噬細胞23hSQ22536+ PGE2 組:30μmol/L SQ22536 預處理 1h 后加 10μmol/L PGE2 處理THP-1巨噬細胞23hH89++ PGE2 組:10μmol/L H89 預處理 1h 后加 10μmol/L PGE2 處理 THP-1巨噬細胞23h上述各組處理的細胞培養(yǎng)上清棄去,PBS洗滌細胞后繼續(xù)無血清基礎培養(yǎng)基裴洋8h后取細胞培養(yǎng)上清HUVECs,分別以Matrigel實驗觀察不同處理下HUVECs體外成管面積的差異,從而研究PGE2對THP-1巨噬細胞株促進體外血管生成的影響。3.SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)處理分析,結(jié)果用均數(shù)±標準差表示,多樣本均數(shù)比較應用方差分析,方差齊選用LSD方法,方差不齊則用Duimett T3法,結(jié)果:與空白對照組相比,1μmol/LPGE2組HUVECs成管面積增大(P0.05);與空白對照組相比,10μmol/LPGE2組HUVECs成管面積增大(P0.05);與1μmol/L PGE2組相比,10μmol/L PGE2組HUVECs成管面積也明顯增大(P0.05);AH6809+ PGE2 組的 HUVECs 成管面積較 10μmol/L PGE2 組的小(P0.05),AH23848+ PGE2的HUVECs成管面積與10μmol/L PGE2組相比無統(tǒng)計學差異;SQ22536+ PGE2組和H89+ PGE2組的HUVECs遷移數(shù)目與10μmol/L PGE2組相比均減小(P0.05)。結(jié)論:1.PGE2處理THP-1巨噬細胞能增強HUVECs體外成管能力。PGE2處理THP-1巨噬細胞后,能明顯增強HUVECs體外成管的能力。其增強的能力與PGE2呈濃度-梯度效應,這與Westemblot的結(jié)果相一致。2.PGE2處理THP-1巨噬細胞能增強HUVECs體外成管能力的機制。EP2拮抗劑AH6809、腺苷酸環(huán)化酶抑制劑SQ22536和PKA抑制劑H89均能抑制PGE2增強THP-1巨噬細胞能促進HUVECs體外能力,這和Westemblot的結(jié)果以及Transwell的結(jié)果相一致,因此證明PGE2通過EP2-cAMP-PKA通路調(diào)控THP-1巨噬細胞株VEGF蛋白表達進而調(diào)節(jié)血管生成功能。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R714.8

【參考文獻】

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本文編號：2250689