研究目的： 1.分析HPV16/18E6/E7癌基因序列信息,構建靶向于HPV16/18E6/E7不同靶點的TALEN質粒,利用體外的報告系統初步篩選出切割效率最好而毒副作用最小的TALEN;同時對TALEN的FokI切割域和骨架系統進行優(yōu)化,篩選出切割效率最高的的TALEN。 2.再將TALEN應用到各種細胞系中,從E6E7DNA拷貝數的變化、細胞內靶序列的切割效率、癌蛋白表達情況、細胞凋亡以及細胞增殖等方面驗證TALEN的細胞內效應和特異性。 3.以mRFP表達建立小鼠陰道內轉染體系,評價陰道內轉染質粒的基因表達、分布等情況,再以靶向EGFP的TALEN質粒(TAL-EGFP)轉染到系統表達EGFP的轉基因小鼠陰道內,利用EGFP熒光表達評價陰道內轉染TALEN的作用效果,以此優(yōu)化轉染體系,為后續(xù)在轉基因小鼠陰道內直接轉染靶向HPV的TALEN表達質粒治療CIN或宮頸癌建立基礎,為CIN或宮頸癌的治療與預防提供新的策略。 研究方法： 1.分析高危性HPV16和HPV18的E6E7癌基因序列,在E6E7癌基因翻譯起始點或主mRNA剪接體的起始外顯子之內挑選出作用靶點,利用Golden Gate Assembly的方法構建TALEN質粒共計16對,隨后利用SSA reporter報告系統對所有的TALEN進行篩選；突變野生型的FokI切割域,將FokI突變體和兩種TALEN骨架進行組合并同樣用SSA reporter系統篩選效率最高毒副作用最小的組合方式進行組裝優(yōu)化。 2.將優(yōu)化的TALEN分別轉入SiHa、HeLa、C33A、S12和293T細胞系,利用T7E1實驗檢測細胞內DSB用于間接反應TALEN在細胞內的切割效率;熒光原位雜交技術檢測細胞內HPV E6E7基因的拷貝數變化;Western blotting檢測HPV16/18E6E7癌基因及其下游基因的蛋白表達情況；流式細胞術檢測細胞凋亡；CCK-8實驗檢測細胞增殖情況。 3.采用單次或多次不同劑量給藥的方式在小鼠陰道內直接轉染mRFP表達質粒,小鼠陰道脫落細胞直接鏡下觀察細胞發(fā)光情況,監(jiān)測轉染效率；選取不同給藥劑量的不同時間點處死小鼠,取出小鼠宮頸陰道部組織,冰凍切片觀察紅色熒光在組織內的分布情況,優(yōu)化陰道內轉染的條件；再按照此條件在EGFP轉基因小鼠陰道內轉染FLAG標記的靶向EGFP的TAL-EGFP,取組織冰凍切片觀察EGFP綠光變化情況,再用4%多聚甲醛固定后石蠟包埋切片,通過攜帶的FLAG標簽的免疫組化染色確定TAL-EGFP質粒的表達在組織內的分布情況。通過HE染色和小鼠CD45的免疫組化染色確定轉染是否誘導局部的炎癥。 研究結果： 1.經過SSA reporter系統的篩選,所有構建的16對TALEN質粒均能有效的切割DNA,切割效率最好的分別是靶向于HPV16E6的T27,靶向于HPV16E7的T512,靶向于HPV18E6的T34和靶向于HPV18E7的T519；+63截短型骨架與S+KKR/ELD的突變型Fokl的組合的切割效率最高,因此將上述4對TALEN質粒全部裝上這一骨架系統。 2.將優(yōu)化的4對TALEN分別轉入SiHa、HeLa、C33A、S12和293T細胞后,(1)T7E1實驗檢測經T27或T512處理的SiHa和S12細胞、T34或T519轉染的HeLa細胞樣品均得到陽性的結果。(2)熒光原位雜交技術檢測發(fā)現T512轉染后的SiHa和S12細胞里的HPV16DNA拷貝數降低,T519處理后的HeLa細胞里的HPV18DNA拷貝數降低。(3) Western blotting結果顯示T27、T34能特異性的誘導HPV16E6和HPV18E6蛋白的下調,同時檢測到E6下游的靶蛋白p53的上調；T512、T519能特異性的誘導HPV16E7和HPV18E7蛋白的下調,以及E7下游的CDK2蛋白的表達上調。(4)細胞凋亡結果顯示T27和T512僅能引起HPV16陽性的細胞系SiHa和S12的明顯凋亡,對HPV18陽性的HeLa無明顯誘導凋亡作用；T34和T519僅能引起HeLa的凋亡,而對SiHa無明顯作用；所有這4對TALEN對HPV陰性的宮頸癌細胞系C33A和正常人胚腎細胞系293T都無誘導凋亡作用。(5)細胞增殖實驗顯示,T27和T512僅特異性的抑制SiHa和S12的細胞增殖,對HeLa、C33A、293T的生長無明顯抑制作用；T34和T519僅特異性的抑制HeLa的增殖,對其他4株細胞系均無明顯影響。 3. mRFP質粒在小鼠陰道內轉染后48小時即可檢測到明顯的發(fā)光情況,并且至少6天內可觀察到熒光；通過比較不同濃度不同轉染量的發(fā)光情況,對陰道內轉染體系進一步的優(yōu)化；觀察到轉染的質粒表達范圍大部分限定在宮頸和陰道的上皮內；陰道內轉染的TAL-EGFP可以在體內有效的切割EGFP表達序列,阻止EGFP轉基因小鼠陰道內的EGFP蛋白的繼續(xù)表達,使得宮頸陰道局部的EGFP熒光減弱甚至消失；證明體內轉染質粒對局部無損傷,不會誘導急性炎性反應。 研究結論： 1.對構建出8對靶向于HPV16E6E7和8對靶向于HPV18E6E7的TALEN質粒進行篩選后得出效果最好的4對分別是靶向于HPV16E6的T27,靶向于HPV16E7的T512,靶向于HPV18E6的T34和靶向于HPV18E7的T519,并對FokI切割域和骨架系統進行了優(yōu)化。 2.T27、T512、T34和T519在相應HPV陽性的細胞內有效的切割靶向HPV序列,引起HPV拷貝數的降低,相應HPV癌基因表達的下調以及下游p53或RB1通路的上調,最終誘導細胞的凋亡,抑制細胞的增殖,而對其他HPV亞型陽性的細胞或HPV陰性的細胞無作用。 3.小鼠陰道內轉染TALEN質粒可以有效到達小鼠宮頸局部組織,有效地切割宮頸上皮組織內的靶向序列,阻礙目的蛋白的表達。并且小鼠陰道內轉染不引起陰道局部的急性炎癥反應,對局部組織無損傷,可以用于宮頸局部的基因治療。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R737.33

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本文編號：2239443