本文選題：EOC + c-Abl��； 參考：《重慶醫(yī)科大學》2014年博士論文

【摘要】：女性生殖器官最常見三大惡性腫瘤包括子宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌和卵巢惡性腫瘤，發(fā)病率均呈逐年上升趨勢。卵巢惡性腫瘤的發(fā)病率位居前兩位之后，但其死亡率卻高居第一。由病理學檢查確診，卵巢惡性腫瘤中約有85%～90%為卵巢惡性上皮性腫瘤。上皮性卵巢癌（Epithelial ovarian cancer, EOC）死亡率高主要原因有以下幾點：1）卵巢隱匿于盆腔深部，檢查時不易及時發(fā)現(xiàn)病變卵巢；2）絕大多數(shù)EOC患者早期無明顯癥狀和體征，不易發(fā)現(xiàn)，確診時有75%以上的患者疾病已經(jīng)進展到腫瘤中晚期（FIGO III～IV期）；3）EOC在腫瘤早期時就具有盆腹腔播散轉(zhuǎn)移的特性，且術(shù)后極易復發(fā)；4）EOC患者對于鉑類、紫杉醇等一線化療藥物易產(chǎn)生耐藥。近幾年，臨床上即使采取了腫瘤細胞減滅術(shù)加聯(lián)合藥物化療等綜合治療手段，同時改進了術(shù)中方法和增加新的靶向治療方案，但對于EOC患者來說，并未有效地改善其預后。根據(jù)文獻資料表明，EOC患者的5年生存率始終徘徊在30%左右。據(jù)報道，世界上每年有近204,000名的新發(fā)病例，約125,000名女性不幸死于卵巢癌，對廣大婦女的家庭生活和健康造成嚴重威脅。目前，對于EOC的發(fā)病機制尚未闡明。侵襲和轉(zhuǎn)移是導致卵巢癌治療失敗和患者死亡的主要原因，因此探討卵巢癌的惡性生物學行為及其發(fā)生的分子生物學基礎(chǔ)一直是婦科腫瘤研究領(lǐng)域中的熱點。 惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移是一種復雜的惡性生物學行為，癌細胞先在原發(fā)病變區(qū)域增殖，繼而向周圍鄰近組織浸潤并使其發(fā)生破壞，然后脫離原發(fā)病灶，經(jīng)血道及淋巴道轉(zhuǎn)移，在遠處器官形成單個或多個轉(zhuǎn)移瘤。在這一系列過程中，關(guān)鍵環(huán)節(jié)在于癌細胞向周圍正常組織的浸潤侵襲，而啟動這一步驟依賴于癌細胞的極化運動能力。癌細胞的侵襲過程，主要是通過調(diào)節(jié)細胞肌動蛋白的聚合及解聚提供的動力，使癌細胞偽足得到支持能夠維持延伸而發(fā)生遷移。致力于探究肌動蛋白如何在腫瘤細胞侵襲偽足部位聚合，如何調(diào)節(jié)各肌動蛋白之間的協(xié)作，也許可以達到控制癌細胞侵襲的目的。本課題組前期在“吸煙與粘液性卵巢癌的發(fā)病相關(guān)性”以及“上皮性卵巢癌早期診斷研究”中采用反向捕獲抗體芯片，發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者血清中均存在WAVE1（Wiskott-Aldrich syndrome protein family verprolin-homologous protein1, WAVE1）蛋白升高，具有血清差異性表達意義，提示其可能是EOC的一個標志蛋白。通過課題組成員前期研究發(fā)現(xiàn)，WAVE1作為一種新型肌動蛋白調(diào)節(jié)蛋白，在EOC的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移等惡性行為中發(fā)揮著重要的作用，同時研究發(fā)現(xiàn)ABL酪氨酸激酶參與WAVE1介導的肌動蛋白骨架重排過程。c-Abl酪氨酸激酶屬于非受體Abelson酪氨酸激酶超家族中的一員，由于在其羧基端具有F-actin、G-actin結(jié)構(gòu)域。在一定的條件下，c-Abl激酶可以直接同纖維性和球形肌動蛋白相結(jié)合，在細胞骨架重排和細胞偽足（如絲狀偽足、侵襲性偽足）聚集形成過程中扮演著重要角色。研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌、慢性髓性白血病、惡性黑色素瘤、胃腸道間質(zhì)惡性腫瘤等腫瘤中，c-Abl均呈高表達，提示c-Abl可能在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中扮演著重要的角色。伊馬替尼（imatinib/STI571）是一類非受體酪氨酸激酶特異性小分子抑制劑，具有c-Abl、c-kit及PDGFR等多個有效靶點。最早用于慢性髓性白血病的治療，并獲得了令人滿意的臨床效果。在前列腺癌、大腸癌、胃癌等惡性實體腫瘤中伊馬替尼的治療作用也得到肯定。近年來，國外有學者進行關(guān)于伊馬替尼類酪氨酸激酶抑制劑在治療復發(fā)性卵巢癌、難治性卵巢癌及對鉑類和紫杉醇耐藥的卵巢癌治療效果的臨床藥理實驗。研究發(fā)現(xiàn)，對于存在酪氨酸激酶表達的卵巢癌患者，伊馬替尼也許能獲得一定的臨床受益。但目前對于c-Abl在EOC中的相關(guān)基礎(chǔ)研究較少。因此，本課題將從以下四個部分對c-Abl在EOC發(fā)生發(fā)展及侵襲行為中的作用進行研究，以期探討c-Abl在EOC惡性生物學行為中可能涉及的分子機制，為非受體酪氨酸激酶抑制劑治療卵巢癌的臨床可行性補充理論依據(jù)。 第一部分c-Abl在上皮性卵巢腫瘤中的表達及其臨床意義 目的 檢測在不同EOC標本中c-Abl蛋白表達情況，探討c-Abl的表達與EOC患者臨床病理特征之間的關(guān)聯(lián)性。 方法 （1）采用免疫組織化學測定22例正常卵巢組織，28例良性卵巢腫瘤組織，18例交界性卵巢腫瘤組織及137例EOC組織標本中c-Abl的表達情況，分析c-Abl的異常表達與其臨床病理特征的相關(guān)性。 （2）采用Western blot測定18例正常卵巢組織標本，17例卵巢良性腫瘤組織標本，14例卵巢交界性腫瘤組織標本和32例EOC組織標本中c-Abl的表達情況，分析c-Abl的異常表達與其臨床病理特征的相關(guān)性。 （3）應用Kaplan-Meier生存分析比較不同EOC組織標本中c-Abl表達強弱對患者生存時間的影響；Cox回歸分析研究關(guān)于EOC患者生存時間的相關(guān)影響因素。 （4）采用Western blot檢測不同人卵巢癌細胞株（SKOV3、3AO、OVCAR-3、ES-2）中c-Abl蛋白表達情況，應用激光共聚焦顯微鏡技術(shù)探究c-Abl在人卵巢癌細胞株中的亞細胞定位。 結(jié)果 （1）免疫組化結(jié)果顯示，在137例EOC組織標本中，c-Abl呈強陽性表達有94例（68.6%），低表達或不表達者有43例（31.4%）；在正常卵巢組織21例（95.5%）、卵巢良性腫瘤24例（85.7%）及卵巢交界性腫瘤14例（77.8%）呈c-Abl不表達，差異有顯著統(tǒng)計意義（P＜0.05）。在EOC中，F(xiàn)IGO分期中III～IV期的c-Abl蛋白表達水平顯著高于I～II期組織（P＜0.001），c-Abl表達水平在病理分化程度為中低分化顯著高于高分化者（P＜0.001），c-Abl表達水平在EOC患者血漿Ca-125≥35U/ml的顯著高于Ca-125＜35U/ml（P=0.019），c-Abl表達在術(shù)后殘余腫瘤直徑≥1cm的EOC患者顯著高于術(shù)后殘余腫瘤直徑＜1cm者（P=0.015），但與EOC患者腹水情況、病灶單雙側(cè)、年齡、腫瘤大小及病理學類型無關(guān)（P＞0.05）。 （2）Western blot結(jié)果顯示，EOC組織標本中c-Abl的表達顯著高于正常卵巢組織、卵巢良性腫瘤組織及卵巢交界性腫瘤組織(分別為：1.704±0.382，0.317±0.062，0.334±0.066，0.346±0.068)，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在EOC組織中，c-Abl蛋白表達水平與EOC組織分化程度、術(shù)后殘余腫瘤直徑大小、患者血漿Ca-125水平、FIGO腫瘤分期有關(guān)（P＜0.05），而與EOC患者腹水情況、病灶單雙側(cè)、年齡、腫瘤大小及病理學類型無關(guān)（P＞0.05）。 （3）Kaplan-Meier生存分析顯示，c-Abl高表達的EOC患者生存時間顯著短于c-Abl低表達的患者（P＜0.05），多變量分析表明不滿意的腫瘤細胞減滅術(shù)、c-Abl高表達和FIGO分期中晚期可能是EOC預后的獨立因素。 （4）c-Abl在SKOV3、3AO、 ES-2、OVCAR-3中的表達分別為：1.044±0.138，0.905±0.096，0.943±0.170，0.855±0.750；通過激光共聚焦顯微鏡觀察到c-Abl與肌動蛋白共表達于細胞膜和細胞質(zhì)上。 結(jié)論 （1）c-Abl在不同EOC細胞和組織標本中呈高表達。高表達的c-Abl與EOC腫瘤分化、術(shù)后殘余腫瘤直徑大小、腫瘤分期及患者血漿Ca-125水平有關(guān)。 （2）c-Abl的高表達與EOC侵襲及患者不良預后相關(guān)，提示c-Abl可能在EOC惡性行為中扮演著重要的角色。 第二部分c-Abl基因shRNA慢病毒載體的構(gòu)建及其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人卵巢癌細胞株的篩選 目的 采用RNAi（RNA interference，RNAi）技術(shù)設(shè)計、構(gòu)建c-Abl的shRNA（short hairpin RNA，shRNA）慢病毒包裝載體，鑒定、篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人卵巢癌細胞株（SKOV3），以便為后續(xù)實驗提供基礎(chǔ)。 方法 （1）設(shè)計并化學合成四條含高效特異性靶向c-Abl基因的重組質(zhì)粒和一條陰性對照。主要通過雙酶切實驗以及精確的測定DNA序列對其重組質(zhì)粒進行鑒定。 （2）將經(jīng)序列測定驗證正確的重組質(zhì)粒進行慢病毒包裝，將pMagic7.1轉(zhuǎn)染到293T細胞經(jīng)收集、提純、最后測定病毒滴度。采用慢病毒載體轉(zhuǎn)染法，將包裝好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至SKOV3中，不斷培養(yǎng)并逐步建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株。 （3）采用Western blot方法檢測轉(zhuǎn)染組、未轉(zhuǎn)染組及陰性對照組細胞中c-Abl蛋白表達的變化；采用Real-time PCR測定上述三組細胞中mRNA表達量的變化，驗證并獲得c-Abl基因抑制效果最佳的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株。 結(jié)果 （1）設(shè)計合成四條c-Abl特異性shRNA，經(jīng)雙酶切法及DNA序列測定結(jié)果顯示，成功構(gòu)建了c-Abl基因RNAi的慢病毒載體。 （2）慢病毒載體介導的c-Abl-shRNA1、 c-Abl-shRNA2、c-Abl-shRNA3、 c-Abl-shRNA4和陰性對照成功轉(zhuǎn)入SKOV3，采用嘌呤霉素進行篩選并獲得穩(wěn)定表達的SKOV3單克隆細胞株。 （3）采用Western blot和Real-time PCR檢測和驗證，獲得c-Abl基因抑制效果最顯著的SKOV3-Ri2細胞。 結(jié)論 成功構(gòu)建了c-Abl基因的特異性重組質(zhì)粒。利用慢病毒載體進行包裝，成功篩選獲得c-Abl基因抑制效果最佳的SKOV3，為進一步研究c-Abl在EOC中惡性生物學行為及其可能相關(guān)的分子機制奠定基礎(chǔ)。 第三部分慢病毒介導的c-Abl基因沉默對SKOV3細胞株惡性行為的影響 目的 探究干擾c-Abl基因后對卵巢癌細胞株SKOV3細胞增殖、粘附、生長及侵襲等惡性生物學行為的影響。 方法 （1）采用Transwell小室檢測SKOV3細胞在c-Abl基因沉默前后其遷移和侵襲能力的改變。 （2）采用細胞粘附實驗研究SKOV3細胞在c-Abl基因沉默前后其粘附能力的改變。 （3）采用MTT法測定SKOV3細胞在c-Abl基因沉默前后其增殖能力的改變。 （4）采用軟瓊脂克隆形成實驗觀察SKOV3細胞在c-Abl基因沉默前后其細胞群體增殖能力、依賴性的改變。 （5）采用裸鼠移植瘤實驗觀察SKOV3細胞在c-Abl基因沉默前后其成瘤能力的改變。 結(jié)果 （1）干擾c-Abl表達使EOC細胞侵襲能力受到明顯抑制： Transwell小室遷移結(jié)果顯示，干擾組SKOV3-Ri2穿過聚碳酸脂膜遷移細胞個數(shù)較正常對照組、陰性對照組均明顯減少（P＜0.05）。 Transwell小室侵襲結(jié)果顯示，干擾組SKOV3-Ri2穿過Matrigel侵襲細胞個數(shù)較正常對照組、陰性對照組均明顯減少（P＜0.05）。 細胞粘附實驗顯示，干擾組SKOV3-Ri2的細胞間粘附能力較正常對照組、陰性對照組均顯著下降（P＜0.05）。 （2）干擾c-Abl表達使EOC細胞生長增殖能力受到明顯抑制： MTT結(jié)果顯示，SKOV3-Ri2組細胞在轉(zhuǎn)染后1d、2d、3d、4d以及5d，呈現(xiàn)的細胞生長曲線較正常對照組、陰性對照組平緩，生長速度亦呈現(xiàn)減緩（P＜0.05）。 軟瓊脂克隆形成實驗顯示，SKOV3-Ri2干擾組細胞生長速度較正常對照組、陰性對照組遲緩，形成克隆數(shù)目明顯減少（P＜0.05）。 （3）干擾c-Abl表達使裸鼠皮下成瘤能力受到明顯抑制： 干擾組SKOV3-Ri2形成的移植瘤較陰性對照組瘤體體積小，成瘤能力明顯減弱，生長速度緩慢。 結(jié)論 細胞株SKOV3增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力在c-Abl基因沉默后受到明顯抑制，提示c-Abl可能在EOC的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移等惡性生物學行為中扮演著重要角色，進一步為臨床上應用c-Abl抑制劑治療EOC提供有力的基礎(chǔ)實驗支持。 第四部分c-Abl在上皮性卵巢癌惡性行為中的分子機制研究 目的 探究c-Abl在上皮性卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移及增殖惡性行為中可能涉及的分子機制。 方法 （1）采用HE染色觀察不同裸鼠移植瘤中腫瘤細胞形態(tài)學變化。 （2）采用免疫組織化學和Western blot檢測陰性對照組和干擾組裸鼠移植瘤中與侵襲轉(zhuǎn)移、增殖相關(guān)蛋白E-cadherin、MMP-2、MMP-9、VEGF、cyclin D1的水平變化。 （3）采用Western blot檢測SKOV3細胞中ERK1/2、p-ERK1/2；AKT、p-AKT；P38MAPK、p-P38MAPK蛋白水平的變化在c-Abl基因沉默前后。 結(jié)果 （1）HE染色結(jié)果顯示，SKOV3-Ri2移植瘤腫瘤細胞排列較整齊，可見極性，而SKOV3-NC移植瘤腫瘤細胞失去極性，排列紊亂。 （2）免疫組化和Western blot結(jié)果顯示，在SKOV3-Ri2組中MMP-2、cyclin D1、MMP-9、VEGF蛋白表達水平較SKOV3-NC組顯著降低，，但E-cadherin蛋白表達水平呈現(xiàn)上升（P＜0.05）。 （3）Western blot檢測信號轉(zhuǎn)導通路相關(guān)蛋白水平結(jié)果顯示，相對于SKOV3-NC細胞，SKOV3-Ri2細胞中AKT、p-AKT和p-P38MAPK蛋白明顯降低（P＜0.05）。而P38MAPK、ERK1/2及p-ERK1/2無明顯變化（P＞0.05）。 結(jié)論 在EOC細胞中，上調(diào)的c-Abl可能通過介導PI3K/AKT、P38MAPK信號轉(zhuǎn)導通路，激活其下游相關(guān)效應蛋白參與EOC的惡性行為。c-Abl可能是PI3K/AKT和P38MAPK信號通路中潛在的調(diào)節(jié)因子。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R737.31

【參考文獻】

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本文編號：2008931