本文選題：MRI + 胚胎��； 參考：《浙江大學》2016年博士論文

【摘要】：出生缺陷問題已成為影響人口質量的重要原因之一。引起出生缺陷的因素眾多,其中醫(yī)源性因素不容忽視。x射線、CT的等臨床診斷手段以及某些藥物(如抗腫瘤藥)已被證實有致畸、流產等影響,而像磁共振成像技術(Magnetic Resonance Imaging, MRI)目前還不確定對胚胎發(fā)育是否有影響。MRI是一種基于磁場,收集磁共振產生的信號并重建圖像的成像技術,是繼CT后醫(yī)學影像學的又一重大進步。 CT產生的電離輻射可引起原子構象不可逆轉的改變,造成生物分子離子化或共價鍵的斷裂；MRI產生的電磁輻射只是改變了原子的位置,不會改變生物分子的結構、組成、特性,因而被認為是一種相對安全的成像技術。此外,MRI因其成像靈活性,病人易接受性,可同時評估病理性和生理性參數,無創(chuàng)等特點已成為醫(yī)學成像的重要方法之一,被廣泛應用于臨床診斷、科學研究等方面,極大地推動了影像醫(yī)學、神經生理學和認知神經科學的迅速發(fā)展。但在早期,因MRI成像速度慢,對動態(tài)物體易產生偽影,設備價格高昂等原因限制了該技術在婦產科領域,特別是產科的應用,故未引起研究者對MRI技術對胎兒生長發(fā)育影響的足夠關注。如今,由于MRI技術本身的進步、發(fā)展和普及,在婦產科領域應用越來越廣泛,并作為重要手段應用于妊娠中、晚期產前診斷,為出生缺陷控制發(fā)揮了重要的作用。但也因其廣泛的使用,有越來越多的孕早期胚胎被不可避免地暴露于MRI環(huán)境下,包括亞臨床妊娠的婦女。因此,MRI對胚胎和早中孕期胎兒的安全性問題越來越受人關注。MRI的胚胎安全風險來源于三個方面：強大的靜磁場(Static Magnetic Fields,SMF)、隨時間變化的梯度磁場(Gradient Magnetic Field, GMF)及脈沖射頻磁場(Radio-Frequency Pulse, RFP)。其中,SMF的危害主要有生物學效應、投射效應,GMF的可能危害主要有：噪聲、電生物效應、外周神經刺激等,而RFP主要危害是熱效應。迄今,對MRI胚胎安全性的研究多為低、中強度SMF的單因素影響研究。GMF和RFP對胚胎影響的研究很少,三種不同磁場的疊加對胚胎影響的研究更少,且研究結果不盡一致,缺乏對三種磁場聯合效應的綜合了解。而且隨著MRI技術不斷完善,為追求更高的空間分辨率、更短的掃描時間,更高強度的磁場必將會被應用,故有關強磁場的安全性的研究刻不容緩。本研究以小鼠10.5dpc (days post coitus)為模型,短時間暴露于工作狀態(tài)下1.5T MRI,并通過胚胎宮內發(fā)育指標評估以及基于TMT標記法和LC-MS/MS的蛋白組學法高通量篩選出受MRI暴露影響的差異表達蛋白,研究1.5TMRI對孕早期胚胎發(fā)育的影響；在此基礎上,通過分析重要分子的表達水平變化,進一步從分子水平角度分析MRI暴露對胚胎發(fā)育過程中哪些重要生物分子的豐度有影響；在體外,我們通過分析細胞增殖、周期、遷移和亞細胞結構進一步研究工作狀態(tài)下的1.5TMRI暴露對細胞生理特性的影響。本研究旨在多角度探尋MRI對胚胎發(fā)育和細胞的影響以及分子機理,為臨床安全合理使用MRI技術提供更充分的科學依據。第一部分1.5T MRI暴露下胚胎宮內發(fā)育及蛋白組學分析目的：以10.5dpc孕鼠為模型,短時間暴露工作狀態(tài)下1.5T MRI后通過測量胚胎宮內發(fā)育指標以及蛋白組學分析研究MRI暴露對胚胎發(fā)育的影響。方法：構建10.5dpc孕鼠,暴露于工作狀態(tài)下1.5T MRI 15min、30min、60min,于18.5dpc剖官測量鼠胚宮內發(fā)育指標；于暴露后4小時和24小時解剖孕鼠,提取胚胎總蛋白,進行基于TMT標記法和LC-MS/MS的蛋白組學分析。結果：1.10.5dpc孕鼠暴露于工作狀態(tài)下1.5T MRI 15min、30min、60min后,至18.5dpc剖官觀察鼠胚宮內發(fā)育情況,發(fā)現均不影響著床總數、胎窩總重、胎盤總重,胚胎存活率、死亡率和吸收率,活胎胎重、身長和尾長等指標。2.與對照組相比,1.5T MRI暴露15min、30min、60min后4小時收集的實驗組蛋白水平上調2倍以上的分別有12個、15個、52個,上調1.5倍以上的分別有104個、82個、162個,下調1/2以上的分別有3個、1個、8個,下調1/3以上的分別有43個、5個、124個；1.5T MRI暴露15min、30min、60min后24小時收集的實驗組蛋白水平上調2倍以上的分別有36個、30個、26個,上調1.5倍以上的分別有105個、128個、122個,下調1/2以上的分別有17個、36個、44個,下調1/3以上的分別有82個、193個、309個。3.取MRI暴露60min后24小時的鼠胚蛋白,蛋白組學篩選到122個上調1.5倍以上的差異表達蛋白,GO分析主要涉及的生物學過程有RNA剪切,mRNA代謝過程,心臟收縮,血液循環(huán)等,主要參與的信號通路有RNA剪接,心肌收縮,肥厚型心肌病(HCM),擴張型心肌�。坏鞍捉M學篩選到309個下調1/3以上的差異表達蛋白,GO分析主要涉及的生物學過程有轉運、細胞分裂、蛋白代謝、RNA代謝等,主要參與的信號通路泛素化介導的蛋白降解、亨廷頓、細胞周期等。結論：1.10.5dpc小鼠胚胎暴露于1.5TMRI 15min,30min,60min后均未發(fā)現著床總數、胎窩總重、胎盤總重,胚胎存活率、死亡率和吸收率,活胎胎重、身長和尾長等指標的改變。2.蛋白組學分析,發(fā)現MRI暴露導致眾多的差異表達蛋白,這些差異表達蛋白參與的信號通路主要有RNA剪接、泛素化介導的蛋白降解途徑等,這些信號通路在胚胎發(fā)育、機體功能建立和維持方面均有重要作用。第二部分1.5T MRI暴露對小鼠胚胎鈣調蛋白和剪接因子影響的分析目的：利用傳統分子生物學方法進一步驗證蛋白組學鑒定到的胚胎短期暴露在工作狀態(tài)下的1.5TMRI后差異表達的重要分子鈣調蛋白和部分剪接因子的差異表達情況。方法：構建10.5dpc孕鼠,暴露于工作狀態(tài)下1.5T MRI 15min、30min、60min,于暴露后4小時和24小時解剖孕鼠,通過熒光定量PCR和Western blot等方法驗證鈣調蛋白和剪接因子的差異表達情況。結果：1.熒光定量PCR結果顯示,10.5dpc孕鼠暴露于工作狀態(tài)下1.5T MRI 15min、 30min、60min,于暴露后24小時解剖孕鼠,發(fā)現同時表達鈣調蛋白的三個基因轉錄水平均有顯著上調。2.10.5dpc孕鼠暴露于工作狀態(tài)下1.5T MRI 15min,30min,60min,于暴露后4小時和24小時解剖孕鼠,經蛋白組學鑒定到59個具有重要分子功能的剪接因子或與剪接相關的蛋白分子,熱圖分析發(fā)現MRI暴露后4小時獲取的胚胎組織相比,24小時獲取的胚胎組織的剪接因子蛋白質相對變化水平更顯著,其中24小時獲取的胚胎組織組中有25個剪接因子差異表達增加在1.2倍以上。3.選取其中8個基因(SCAF11, SR3B6, SRSF1, SRSF3, SRSF4, SRSF5, SRSF6, SRSF7)作熒光定量PCR鑒定,結果顯示10.5dpc孕鼠暴露于工作狀態(tài)下1.5TMRI 15min、30min、60min,于暴露后24小時解剖孕鼠,這8個基因均有一定程度轉錄水平上升,其中Sf3b6和Srsf7的30min和60mmin組與對照組相比基因轉錄水平有顯著差異,Srsf5和Srsf7的15min組與對照組相比基因轉錄水平有顯著差異。4.選取SRSF1,SRSF3, SRSF4和SRSF64個蛋白作Western blot鑒定,結果顯示10.5dpc孕鼠暴露于工作狀態(tài)下1.5T MRI 15min,30min,60min,于暴露后24小時解剖孕鼠,這四個蛋白均有顯著降低。5. 收取不同時期(9.5/10.5/11.5/12.5/13.5/14.5/15.5/16.5/17.5dpc)小鼠胚胎組織,Western blot檢測發(fā)現9.5dpc時,SRSF1, SRSF3和SRSF6的蛋白表達均較弱,而SRSF4相對處于較高的豐度。在10.5dpc至14.5dpc期間,SRSF1, SRSF3, SRSF4和SRSF6均保持在相對穩(wěn)定且表達水平較高的階段,之后蛋白的表達水平均有不同程度下調。6.將10.5dpc孕鼠暴露于MRI下60min,并在MRI暴露后12h/24h/48h/72h時期收集小鼠胚胎組織,Western blot檢測發(fā)現SRSF1, SRSF3, SRSF4和SRSF6的蛋白水平MRI暴露后一定時間內均能有所恢復,其中SRSF1和SRSF3在MRI暴露后24小時蛋白下降顯著,并在48小時顯著恢復；SRSF4在MRI暴露后12小時即開始下降,24小時有一定程度恢復,而在48小時顯著恢復；SRSF6在MRI暴露后48小時呈顯著下調,在72小時有一定程度恢復。結論：1.10.5dpc小鼠胚胎暴露于工作狀態(tài)下1.5TMRI 60min,可引起鈣調蛋白基因的轉錄水平上調,提示MRI暴露可能干擾了胚胎組織鈣調蛋白介導的信號轉導通路。2.選取其中八個剪接因子的基因做熒光定量PCR驗證,提示小鼠胚胎組織經過MRI暴露后部分剪接因子的表達發(fā)生變化,這有可能影響胚胎組織可變剪接的調控過程,甚至影響胚胎發(fā)育。3. Western blot檢測發(fā)現SRSF1, SRSF3, SRSF4和SRSF6的蛋白水平在MRI暴露后24小時均有下降并在暴露后一定時間內有所恢復,提示在分子水平MRI短期暴露對胚胎確有一定影響,且這種影響是可逆的。4. SRSF1, SRSF3, SRSF4和SRSF6蛋白水平在胚胎發(fā)育不同時期高度動態(tài),提示其蛋白水平根據胚胎發(fā)育狀況和階段嚴格受到機體嚴密調控,在胚胎發(fā)育某階段蛋白水平上調或下調均有可能影響胚胎的正常發(fā)育。第三部分1.5T MRI暴露對細胞生理特性的影響目的：為進一步研究工作狀態(tài)下1.5TMRI的生物學效應,我們在細胞水平通過檢測細胞增殖、周期、遷移、亞細胞結構等生理特性的改變?yōu)樯钊胙芯刻接慚RI安全性提供理論依據。方法：利用自制恒溫箱實現細胞短期暴露于工作狀態(tài)下1.5T MRI,通過流式細胞術、WST-1法、細胞劃痕實驗和透射電子顯微鏡檢測細胞在MRI暴露后周期、增殖、遷移以及亞細胞結構等的變化情況。結果：1.WST-1法檢測細胞增殖結果顯示,經MRI暴露60min后的Swan71細胞生長較對照組細胞生長明顯減慢,差異在暴露后24h開始體現,第48h兩組生長速度差異顯著(P=0.005634),第96h兩組細胞密度相差一倍,P=0.00007。2.流式細胞術結果顯示,MRI暴露60min后Swan71細胞周期分布與正常對照組相比無統計學差異(P0.5)。3.細胞劃痕實驗結果顯示,SiHa細胞在MRI暴露60mmin后細胞遷移速度相比于對照組有明顯減慢。隨機統計對照組20個位置細胞的遷移情況,發(fā)現24小時后平均遷移65.271μm,而隨機統計實驗組22個位置的細胞遷移情況,發(fā)現24小時候平均遷移45.94μm,兩組比較有顯著統計學差異(P0.001)4.透射電子顯微鏡結果顯示,經MRI暴露60min后的Swan71細胞核輕度固縮,核周隙存在,核仁輕度團聚；線粒體腫脹明顯,變大變圓,質膜完整,基質變淺、嵴變短變少;粗面內質網未擴張成囊狀或者小泡。結論：1.1.5T MRI暴露60mmin后降低人滋養(yǎng)細胞Swan71的細胞增殖速度,但并不影響細胞周期分布。2.1.5T MRI暴露60mmin后降低SiHa細胞的遷移能力。3.1.5T MRI暴露60min后影響人滋養(yǎng)細胞Swan71的亞細胞結構,引起細胞線粒體腫脹。
[Abstract]:Birth defects have become one of the most important factors that affect the quality of population . The factors that cause birth defects are numerous , such as X - ray , CT and so on . Magnetic Resonance Imaging ( MRI ) has been proved to have influence on embryonic development . MRI is a magnetic resonance imaging technique that collects signals generated by magnetic resonance and reconstructs image , which is another important progress in medical imaging following CT . The ionizing radiation produced by CT can cause irreversible changes in atomic conformation , resulting in the ionization or covalent bond of biomolecules ;
MRI浜х敓鐨勭數紓佽緪灝勫彧鏄敼鍙樹簡鍘熷瓙鐨勪綅緗，

本文編號：1973892