本文選題：卵巢癌 + 細(xì)胞系�。� 參考：《揚(yáng)州大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：—. MUC4、MUC16在卵巢癌細(xì)胞系癌變機(jī)制研究背景與目的：卵巢癌是目前死亡率最高的婦科惡性腫瘤。70%的卵巢癌患者診斷時(shí)已達(dá)中晚期。卵巢癌被描繪為“沉默殺手”。標(biāo)準(zhǔn)的卵巢癌治療是手術(shù)加聯(lián)合化療(鉑-紫杉醇),大多數(shù)病人最初對(duì)化療有反應(yīng),大約25%的患者對(duì)治療無(wú)反應(yīng)。對(duì)于經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)治療后的晚期患者大約只有60-80%反應(yīng)率,最終卵巢癌復(fù)發(fā),中期生存時(shí)間僅為18個(gè)月。因此,尋找新的早期診斷方法和治療策略十分必要,才有可能提高晚期患者生存率。卵巢上皮癌(EOC)大約占所有卵巢腫瘤的90%,常直接播散到鄰近器官。卵巢癌患者的生存期與早期診斷密切相關(guān)。5年生存率在工期大約90%,而Ⅲ-Ⅳ期卵巢癌一旦腫瘤播散到盆腔五年生存率大約是17-29%。卵巢癌難以及時(shí)和早期診斷的因素涉及到缺少特征性臨床表現(xiàn)和早期診斷特異性標(biāo)志物。目前陰道超聲和血漿CA125水平是最常用的卵巢癌篩查方法。但臨床應(yīng)用這些方法監(jiān)測(cè)早期卵巢上皮癌由于缺少特異性和敏感性,效果受到限制。卵巢上皮癌起源于卵巢上皮表面組織,黏蛋白(mucin,MUC)是有診斷價(jià)值的生物學(xué)標(biāo)志物。克隆的CA125基因由于它的產(chǎn)物與粘蛋白家族蛋白類似被稱之為MUC16。研究發(fā)現(xiàn)CA125(MUC16)的水平上升是診斷卵巢癌最常用標(biāo)準(zhǔn)。但近50%早期卵巢癌患者CA125水平未出現(xiàn)上升甚至部分卵巢癌晚期患者CA125水平也未上升,且CA125水平上升也見(jiàn)于其他癌癥和良性病變。在卵巢癌患者為何CA125水平在早期、晚期只有部分升高甚至不升高目前尚不清楚其機(jī)制。用CA125 (MUC16)作為早期診斷卵巢癌標(biāo)志物存在明顯不足,尋找新的血漿標(biāo)志物配合CA125有可能促進(jìn)早期診斷。MUC4是黏蛋白家族的成員之一,在細(xì)胞黏附、運(yùn)動(dòng)、信號(hào)傳導(dǎo)、組織再生和分化、腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中均起到重要作用。MUC4表達(dá)水平可反映患者腫瘤活躍狀態(tài),并成為判斷腫瘤預(yù)后及是否早期轉(zhuǎn)移的指標(biāo)。本研究對(duì)卵巢癌SK0V3、0VAR3、CA0V3三種細(xì)胞系行細(xì)胞培養(yǎng)蛋白濃度測(cè)定,用半定量PCR、熒光定量PCR分析細(xì)胞MUC4、 MUC16mRNA水平,采用Western Blot、免疫細(xì)胞化學(xué)SABC法檢測(cè)MUC4、MUC16蛋白表達(dá)水平,目的探索MUC4、MUC16基因在卵巢癌細(xì)胞系致癌機(jī)制、在RNA水平和蛋白水平表達(dá),并揭示臨床早期或晚期卵巢癌患者CA125水平正常或不上升機(jī)制。方法1、細(xì)胞培養(yǎng)人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞、OVCAR-3細(xì)胞培養(yǎng)于高糖DMEM+10%胎牛血清+1ml青/鏈霉素的培養(yǎng)基中,人卵巢癌CAOV-3細(xì)胞培養(yǎng)于McCoy' 5A+10%胎牛血清+1ml青/鏈霉素的培養(yǎng)基中,三種細(xì)胞均置于37℃,5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2、總RNA的提取和RT-PCR檢測(cè)應(yīng)用RT-PCR技術(shù),檢測(cè)人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞、OVCAR-3細(xì)胞、CAOV-3細(xì)胞中MUC4及MUC16 mRNA水平的表達(dá),以GAPDH作為內(nèi)參。提取細(xì)胞總RNA,以mRNA為模板,在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以cDNA為模板,用MUC4及MUC16相應(yīng)引物特異性擴(kuò)增相應(yīng)基因。半定量RT-PCR產(chǎn)物,包括237bp (MUC4)和114bp (MUC16),用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行半定量檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)結(jié)束后分析擴(kuò)增曲線和融解曲線,用Comparative Delta-delta Ct進(jìn)行相對(duì)定量分析。3、細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞、OVCAR-3細(xì)胞、CAOV-3細(xì)胞中MUC4及MUC16蛋白表達(dá)情況。將細(xì)胞均勻種植于鋪有細(xì)胞爬片的24孔板中,培養(yǎng)箱中孵育24h,棄掉孔內(nèi)培養(yǎng)液,PBS洗3遍,取出細(xì)胞爬片,4%多聚甲醛固定30min,3%H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,封閉液37℃孵育1h,一抗4℃孵育過(guò)夜,然后用二抗37℃避光孵育1h,PI染核后封片,在熒光倒置顯微鏡下觀察結(jié)果。4、免疫細(xì)胞化學(xué)SABC法細(xì)胞免疫化學(xué)SABC法與細(xì)胞免疫熒光法相似,可用于檢測(cè)人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞、OVCAR-3細(xì)胞、CAOV-3細(xì)胞中MUC4及MUC16蛋白表達(dá)情況。5、Westen Blot實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Westen Blot方法檢測(cè)人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞、OVCAR-3細(xì)胞、CAOV-3細(xì)胞中MUC4及MUC16蛋白表達(dá)水平,以β-actin作為內(nèi)參。提取三種細(xì)胞樣本的蛋白,制備蛋白樣本,進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育、顯色。結(jié)果1、RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：MUC4在人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞、OVCAR-3細(xì)胞、CAOV-3細(xì)胞中表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)：MUC16 mRNA在人卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞中表達(dá)量最高,CAOV-3細(xì)胞次之,SKOV-3細(xì)胞表達(dá)量最低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2、細(xì)胞免疫熒光法、免疫細(xì)胞化學(xué)法及Westen Blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：MUC4蛋白在人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞和OVCAR-3細(xì)胞中不表達(dá),在CAOV-3細(xì)胞中有表達(dá)；MUC16蛋白在人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞、OVCAR-3細(xì)胞、CAOV-3細(xì)胞中均有表達(dá),并且在OVCAR-3細(xì)胞中表達(dá)最高,在CAOV-3細(xì)胞次之,在SKOV-3細(xì)胞中表達(dá)最低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1、人卵巢癌SKOV-3、OVCAR-3和CAOV-3三種細(xì)胞系中MUC4及MUC16在mRNA水平及蛋白水平表達(dá)情況各不相同,早期卵巢癌50%病人CA125(MUC16)水平正常、或晚期病人CA125(MUC16)水平不上升與CA125(MUC16)在不同類型卵巢癌不表達(dá)或低表達(dá)有關(guān)。2、MUC4及MUC16與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系,MUC4可能單獨(dú)或聯(lián)合MUC16作為卵巢癌臨床診斷的輔助實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。二.MUC4、MUC16和NF-κB/p65在正常卵巢組織和卵巢腫瘤的表達(dá)及與卵巢癌臨床病理關(guān)系研究背景和目的：卵巢癌是目前排列第二位的婦科惡性腫瘤,上皮性卵巢癌是最常見(jiàn)和廣泛腹腔轉(zhuǎn)移的卵巢癌,由于缺少特征臨床癥狀和敏感的腫瘤標(biāo)志物,通常在中晚期才被診斷,加上卵巢癌治療過(guò)程中易產(chǎn)生耐藥性,成為最致命的婦科惡性腫瘤。目前最常用的卵巢癌早期篩查方法包括血漿CA125水平檢測(cè)、陰道超聲檢查。但臨床應(yīng)用這些方法監(jiān)測(cè)早期卵巢上皮癌由于缺少特異性和敏感性效果受到限制。近50%早期卵巢癌患者CA125水平未出現(xiàn)上升,且CA125水平上升也見(jiàn)于其他癌癥和良性病變。用CA125(MUC16)作為早期診斷卵巢癌標(biāo)志物存在明顯不足,尋找新的血漿標(biāo)志物配合CA125有可能促進(jìn)早期診斷。MUC4在不同類型腫瘤組織研究顯示表達(dá)明顯,且與MUC16聯(lián)合檢測(cè)能提高M(jìn)UC16早期診斷價(jià)值,MUC4可能是較好的候選腫瘤標(biāo)致物,此外,近期研究MUC4在卵巢癌腹腔擴(kuò)散細(xì)胞出現(xiàn)高表達(dá)。NF-κB為一種家族轉(zhuǎn)錄基因,能調(diào)節(jié)超過(guò)400種基因,這些被調(diào)節(jié)的基因包括多種細(xì)胞因子、炎癥前因子基因、附分子、凋亡基因和其他轉(zhuǎn)錄因子。NF-κB能促進(jìn)卵巢細(xì)胞增生并與化療抵抗有關(guān)。近來(lái)有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)黏附分子基因上主要區(qū)域和啟動(dòng)點(diǎn)位置存在NF-κB識(shí)別位點(diǎn),NF-κB可促進(jìn)一些黏蛋白啟動(dòng)子激活和基因表達(dá),從而調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附功能及轉(zhuǎn)移發(fā)展。在卵巢癌發(fā)生和發(fā)展中,黏蛋白的表達(dá)與臨床病理關(guān)系及NF-κB與黏蛋白共同影響卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)采用免疫細(xì)胞化學(xué)SP法檢測(cè)MUC4、MUC16和NF-κB/p65在正常卵巢組織和卵巢上皮性腫瘤中的表達(dá),分析這些基因的表達(dá)與卵巢癌臨床病理相關(guān)性,為卵巢癌的早期診斷、預(yù)后判斷尋找標(biāo)志物及提供理論依據(jù)。方法：采用免疫細(xì)胞化學(xué)SP法,檢測(cè)MUC4、MUC16和NF-κB/p65在10例正常卵巢組織、20例卵巢良性上皮性腫瘤,10例卵巢交界性上皮性腫瘤,40例卵巢惡性上皮性腫瘤中的表達(dá)及與臨床病理關(guān)系：研究對(duì)象入院后在空腹情況下抽取肘靜脈血2ml,分離血清用于CA125檢測(cè)。結(jié)果：(1).MUC4、MUC16、NF-κB/p65在正常卵巢組織、良性卵巢腫瘤和卵巢癌陽(yáng)性表達(dá)程度不同：MUC4在正常卵巢組織、良性腫瘤、交界性腫瘤和卵巢癌陽(yáng)性表達(dá)率分別為0、10%(2/20)、40%(4/10)、90%(36/40)；MUC16分別為為10%(1/10)、20%(4/20)、60%(6/10)和87.5%(27/52)；NF-κB/p65分別為10%(1/10)、20%(4/20)、60.0%(6/10)和85.0%(34/40)。(2)MUC4、MUC16、NF-κB/p65在卵巢癌不同亞型表達(dá)情況：MUC4在漿液性卵巢癌、粘液性卵巢癌和其他類型卵巢上皮癌陽(yáng)性表達(dá)率分別為86.36%(19/22)、75%(8/12)和50%(3/6),漿液性和粘液性兩組差異不顯著(p0.05)。MUC16陽(yáng)性表達(dá)率分別為81.81%(18/22)、25%(3/12)和50%(3/6),漿液性和粘液性兩組異顯著(p(0.05)。NF-κB/p65陽(yáng)性表達(dá)率分別為86.36%(19/22)、33.33%(4/12)和33.33%(2/6),漿液性和粘液性兩組差異顯著(p0.05)。在漿液性卵巢癌MUC4、MUC16和NF-κB/p65都出現(xiàn)較高的陽(yáng)性表達(dá)率,在粘液性卵巢癌MUC4的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于MUG16和NF-κB/p65,差異有顯著性(p0.05)。(3)MUC4、MUC16、NF-κB/p65卵巢癌表達(dá)情況與臨床期別關(guān)系：MUC4在Ⅰ-Ⅱ期和Ⅲ-Ⅳ期卵巢癌陽(yáng)性表達(dá)率分別為91.67%(11/12)和75%(21/28),兩組相比差異顯著(p0.05)。MUC16分別為50%(6/12)和85.7%(24/28),兩組相比較差異顯著(p0.05)。NF-κB/p65分別為58.33%(7/12),82.14%(23/28),兩組相比差異顯著(p0.05)。MUC4在早期卵巢癌表達(dá)明顯高于MUC16和NF-κB/p65,而在晚期卵巢癌三個(gè)標(biāo)志物表達(dá)無(wú)明顯差異。(4)MUC4、MUC16、NF-κB/p65卵巢癌表達(dá)情況與預(yù)后意義關(guān)系：MUC4在有卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽(yáng)性表達(dá)率分別為66.67%(8/12)和57.14%(16/28),兩者無(wú)顯著差異(p0.05)。MUC16分別為83.33%(10/12)和71.42%(20/28),兩組差異顯著(p0.05)。NF-κB/p65分別為為66.67%(8/12)和57.14%(16/24),兩組無(wú)顯著差異(p0.05)。MUC4在高分化和中低分化卵巢癌組陽(yáng)性表達(dá)率分別為77.77%(7/9)和58.06%(18/31),兩者差異顯著(p0.05)。MUC16分別為33.33%(3/9)和83.87%(26/31),兩者差異顯著(p0.05).NF-κB/p65分別為55.55%(5/9)和77.42%(24/31),兩組差異顯著(p0.05)。在血清CA125值升高組卵巢癌和血清CA125值正常組MUC4陽(yáng)性表達(dá)率分別為76.19%(16/21)和84.21%(16/19),兩組相比差異不顯著(p0.05)。MUC16陽(yáng)性表達(dá)率分別為85.71%(18/21)和42.10%(8/19),兩組相比差異顯著(p0.05)。NF-κB/p65陽(yáng)性表達(dá)率分別為85.71%(18/21)和78.94%(15/19),相比差異不顯著(p0.05)。(5)MUC4和MUC16在卵巢癌中的表達(dá)率和表達(dá)程度相互比較,結(jié)果MUC4的表達(dá)率和表達(dá)強(qiáng)度高于MUC16,差異顯著(P0.05),(6)MUC4、MUC16和NF-κB/p65相關(guān)性比較：MUC4與NF-κB/p65呈正相關(guān)(r=0.69,p0.01)； MUC16與NF-κB/p65呈正相關(guān)(r=0.58,p0.01)。結(jié)論： (1)MUC4、MUC16和NF-κB/p65在卵巢癌出現(xiàn)過(guò)度表達(dá)。MUC4、MUC16和NF-κB/p65與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)；MUC4在早期卵巢癌表達(dá)明顯,MUC16過(guò)度表達(dá)伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能與預(yù)后不良有關(guān)；MUC4單獨(dú)或聯(lián)合MUC16檢測(cè)可能是有效的標(biāo)志物用于卵巢癌的早期診斷和晚期預(yù)后判斷。(2)在粘液性卵巢癌MUC4的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于MUC16和NF-κB/p65,MUC4可用于臨床粘液性卵巢癌診斷和鑒別診斷：(3)MUC4、MUC16和NF-κB/p65表達(dá)相關(guān)性研究,結(jié)果提示黏蛋白與NF-κB/p65表達(dá)相關(guān)性較好,黏蛋白的表達(dá)可能受NF-κB/p65的調(diào)控。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R737.31

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本文編號(hào)：1853187