本文選題：卵巢癌 + 多藥耐藥��； 參考：《吉林大學》2014年博士論文

【摘要】：上皮型卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）是惡性程度極高的婦科腫瘤。據估計，2011年在美國有21990新發(fā)病例，并且有15460例死亡。鉑/紫杉醇為基礎的化療是EOC分期手術和切除術后的現行治療標準。盡管化療在EOC的治療上取得一定的成效，但其預后很差，存在腹部或盆腔復發(fā)現象，并可進一步發(fā)展耐藥性。而耐藥性的產生，是導致卵巢癌死亡率居高不下的重要原因。因此，如何提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，是當前臨床治療EOC亟待解決的問題之一。 腫瘤細胞通常涉及到多基因和多通路的激活，從而獲得對化療和放療誘導的細胞死亡的抵抗能力。已知的幾種細胞死亡方式包括壞死、凋亡和自噬性細胞死亡等。細胞凋亡又稱Ⅰ型程序性細胞死亡，是指生物體為維持其內環(huán)境穩(wěn)定，在特定信號誘導下，由多個基因調控的細胞自主地進行程序性死亡的過程，是放射治療和其他癌癥治療方式的最重要的死亡機制。自噬性細胞死亡是除凋亡外的另一重要的細胞死亡調控機制，在癌癥的發(fā)展中扮演重要的角色。細胞自噬是一種進化上保守的代謝過程，其主要作用是將細胞內功能受損的蛋白質以及多余的或有缺陷的細胞器降解，并對蛋白質和氨基酸等回收和再利用。除了這個關鍵作用，還發(fā)現自噬在其他方面也有重要的職能，特別是在有應激壓力或損傷的情況下會導致自噬顯著增強。自噬在腫瘤發(fā)生發(fā)展及耐藥中發(fā)揮著重要的作用，并且依據腫瘤類型和環(huán)境條件不同而呈現促進或抑制兩種相反的調控結局，即雙向調控作用。因此，闡明自噬在腫瘤的治療中發(fā)揮的作用和機制有利于針對不同類型的腫瘤，尤其放化療抵抗的腫瘤，采取個體化的治療方案而能夠獲得良好的治療效果。 目的：以人卵巢癌細胞株SKOV3及其耐藥表型SKVCR為研究對象，探討自噬在化療及電離輻射誘導的細胞死亡中的作用及其機制，為指導臨床腫瘤綜合治療方案的優(yōu)化以及新治療靶點的探索提供理論依據。 方法：①選用人卵巢癌細胞株SKOV3及其多藥耐藥表型細胞株SKVCR；②應用深部X射線治療機進行細胞照射，照射條件：電壓180kV，電流18.0mA，濾板為0.25mm Cu和1.0mmAl，靶皮距60cm，劑量率0.40Gy· min 1；③藥物選�。篤CR（長春新堿）、THP（吡柔比星）、VP-16（依托泊苷）；④細胞存活檢測采用CCK8（cell counting Kit-8）法和集落形成法；⑤細胞內mRNA的表達采用Real-Time PCR方法檢測；⑥蛋白表達變化采用Western blot檢測；⑦細胞自噬采用GFP-LC3轉染和MDC染色；⑧細胞凋亡檢測采用Hoechst33342染色檢測；⑨細胞凋亡、自噬和細胞周期采用流式細胞術檢測。 結果： 1.不同濃度VCR、VP-16、THP能夠明顯抑制SKOV3及SKVCR細胞的生長，相同藥物濃度作用后，SKVCR細胞的存活率顯著高于SKOV3細胞（P 0.05）。SKVCR中的P-gp蛋白表達量是SKOV3的50倍以上。MDC熒光染色、Real-time PCR及Western blot方法檢測結果發(fā)現，兩種細胞的基礎凋亡水平接近，但耐藥株SKVCR中自噬發(fā)生率明顯高于SKOV3細胞（P 0.05）。 2.不同濃度VCR作用4、8、24、48h可以明顯抑制SKOV3及SKVCR細胞存活，且細胞毒性具有劑量依賴性和時間依賴性；選取0.02μg/ml VCR作用SKOV3細胞后，對細胞凋亡無明顯影響，但細胞自噬率升高到2.63倍；選取10μg/ml VCR處理SKVCR細胞，能夠誘導SKVCR細胞凋亡的發(fā)生（P 0.05），但對自噬無明顯影響。 3.分別取3MA、CQ、Rapamycin和ZVAD以最大無作用劑量處理兩種細胞，發(fā)現3MA和CQ能夠抑制自噬，Rapamycin可以誘導自噬，ZVAD對Caspase-3活化有明顯抑制作用，并顯著抑制凋亡（P 0.05）。 4. VCR與3MA、CQ、Rapamycin、ZVAD單獨或聯合作用SKOV3細胞24h后發(fā)現：3MA和Rapamycin對VCR藥物敏感性無影響；CQ與VCR聯合作用能夠增加低濃度VCR對SKOV3細胞的增值抑制率（P 0.05）；ZVAD能夠降低0.02~0.2μg/ml VCR對SKOV3細胞的增值抑制作用，細胞生存率高于VCR單獨作用組（P 0.05）。MDC染色、流式細胞術及Western blot結果表明，VCR誘導SKOV3細胞發(fā)生自噬，但對凋亡無影響，而預先給予自噬抑制劑3MA和CQ可以降低VCR誘導的細胞自噬（P 0.05），同時增加VCR誘導的SKOV3細胞凋亡，而預先加入ZVAD能夠抑制VCR誘導的細胞凋亡并促進細胞存活（P 0.05）。 5. VCR與3MA、CQ、Rapamycin、ZVAD單獨或聯合作用于SKVCR細胞24h后，與VCR單獨作用相比，3MA/CQ與VCR共同作用能明顯降低細胞生存率，起到化療增敏作用（P 0.05），而Rapamycin則無增敏作用（P0.05）；與VCR單獨作用相比，ZVAD則提高VCR作用后SKVCR的生存率（P 0.05），降低SKVCR對VCR的藥物敏感性。流式細胞術及Western blot結果表明，在VCR給藥前加入自噬抑制劑3MA和CQ，能夠降低VCR誘導的SKVCR細胞自噬（P 0.05），同時增加VCR誘導的SKVCR細胞凋亡，而預先加入ZVAD能夠抑制VCR誘導的細胞凋亡和自噬（P 0.05）。 6.輻射敏感性研究發(fā)現，電離輻射作用于SKOV3和SKVCR細胞可以顯著降低細胞存活率，而且電離輻射對SKOV3及SKVCR的細胞毒性具有劑量依賴性，而在單次照射和分割照射之間沒有差異；SKOV3細胞的輻射敏感性高于其耐藥株（P 0.05）。 7.電離輻射對細胞死亡影響的研究發(fā)現，輻射引起SKOV3細胞核固縮、碎裂、染色增強、濃縮，同時流式細胞術進一步證實不同輻射方式可以誘導SKOV3和SKVCR細胞的凋亡發(fā)生（P 0.05）。電離輻射作用后SKOV3細胞和SKVCR細胞MDC陽性百分率及MAPLC3II/I的比值明顯增加（P 0.05），表明電離輻射能夠誘導發(fā)生凋亡和自噬。 8.調控劑對輻射敏感性的影響：凋亡抑制劑ZVAD對電離輻射誘導的SKOV3和SKVCR細胞死亡率沒有影響，提示電離輻射誘導SKOV3和SKVCR細胞死亡可能是非凋亡依賴性的；而自噬抑制劑3MA使SKVCR細胞生存率顯著下降（P 0.05），顯示輻射增敏作用。 9.調控劑對細胞死亡的影響：應用ZVAD后發(fā)現，與電離輻射單獨作用相比，ZVAD抑制SKOV3和SKVCR細胞凋亡的同時伴隨自噬抑制。應用3MA后發(fā)現，與單獨電離輻射組相比，兩種細胞MDC陽性百分率降低（P 0.05），3MA抑制了電離輻射誘導的自噬；3MA對電離輻射誘導的細胞凋亡作用不同，3MA抑制了輻射誘導的SKOV3細胞凋亡，卻增加了SKVCR的凋亡率（P 0.05）。 10.電離輻射對細胞周期的影響：輻射作用SKOV3和SKVCR細胞，，可誘導G2/M期阻滯（P 0.05）；在SKVCR細胞中，S期細胞占比例較高，而且電離輻射引起S期時相明顯延遲，但是在3MA作用后，發(fā)現輻射最不敏感的S期細胞明顯減少，而相對敏感的G1/M期細胞比例增加（P 0.05）。表明3MA能夠調節(jié)細胞周期再分布，協(xié)同影響輻射的殺傷作用。 結論： 1. SKVCR細胞中的自噬高表達現象是產生化療耐藥的重要機制之一。 2. VCR化療過程中發(fā)現，抑制自噬顯著增加VCR誘導SKVCR細胞凋亡的能力，增加SKVCR細胞對VCR的化療敏感性。 3.電離輻射作用能夠誘導兩種卵巢癌細胞發(fā)生凋亡和自噬，自噬增加SKVCR對電離輻射的抗性。通過3MA抑制SKVCR細胞的自噬，可抑制電離輻射誘導S期延遲并增加輻射誘導的細胞凋亡，而提高放療敏感性。 自噬抑制劑有望成為耐藥型卵巢癌放化療的增敏劑。
[Abstract]:Epithelial ovarian cancer ( EOC ) is an extremely malignant gynecological tumor . It is estimated that there were 21990 new cases in the United States in 2011 , and 15460 died . The platinum / paclitaxel - based chemotherapy was the current treatment standard after EOC .

Autophagy cell death is one of the most important death mechanisms of radiotherapy and other cancer treatments . It is also found that autophagy plays an important role in the development of cancer .

Objective : To study the role and mechanism of autophagy in the cell death induced by chemotherapy and ionizing radiation in human ovarian cancer cell line SKline and its resistant phenotype SKVCR , and to provide a theoretical basis for guiding the optimization of clinical tumor comprehensive treatment scheme and the exploration of new therapeutic target .

Methods : 鈶

本文編號：1809467