卵巢切除對(duì)大鼠空間記憶的影響及其和海馬胰島素信號(hào)相關(guān)性的研究
本文選題:雌激素 + 胰島素; 參考:《蘭州大學(xué)》2014年碩士論文
【摘要】:目的:更年期綜合癥是指女性在圍絕經(jīng)期因雌激素水平下降引起的以自主神經(jīng)功能紊亂為主的一組癥候群。臨床發(fā)現(xiàn)更年期綜合癥患者同時(shí)伴有記憶功能下降。動(dòng)物研究用卵巢去勢(shì)鼠建立手術(shù)更年期模型,通過(guò)Morris水迷宮和恐懼條件反射等行為學(xué)測(cè)試,發(fā)現(xiàn)卵巢去勢(shì)引起的雌激素水平低下可明顯損害空間學(xué)習(xí)記憶;卵巢去勢(shì)鼠用雌激素替代治療,可增強(qiáng)海馬CA1-CA3區(qū)的樹(shù)突棘密度和LTP。雌激素和學(xué)習(xí)記憶的關(guān)系雖然有大量報(bào)道,但雌激素參與腦內(nèi)信息處理的具體機(jī)制仍不明確。此外,神經(jīng)系統(tǒng)高效利用能量的過(guò)程是葡萄糖的有氧氧化,學(xué)習(xí)記憶過(guò)程伴隨著特定腦區(qū)葡萄糖利用率的增加,海馬是學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵腦區(qū),基于任務(wù)模式的學(xué)習(xí)行為可見(jiàn)海馬區(qū)葡萄糖攝取增加。細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取借助于細(xì)胞膜上特定的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體實(shí)現(xiàn),葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體有多個(gè)亞型,其中GLUT4在骨骼肌及脂肪組織分布廣泛,且具有胰島素依賴性的特點(diǎn)。近年發(fā)現(xiàn)海馬神經(jīng)細(xì)胞有GLUT4的表達(dá),這表明海馬神經(jīng)細(xì)胞的葡萄糖利用受胰島素信號(hào)的調(diào)節(jié)。而胰島素信號(hào)及胰島素敏感性受多種信號(hào)的影響,有研究觀察到雌激素可增強(qiáng)胰島素敏感性,同時(shí)發(fā)現(xiàn)雌激素可以調(diào)控胰島素的水平。雌激素對(duì)胰島素的這種調(diào)節(jié)作用是否參與海馬對(duì)信息處理的過(guò)程尚不得而知。因此,本研究我們通過(guò)大鼠卵巢去勢(shì)構(gòu)建雌激素水平低下模型,觀察對(duì)海馬空間記憶的影響及其與腦內(nèi)胰島素信號(hào)的關(guān)系。方法:動(dòng)物處理:SD雌鼠(體重250g左右)隨機(jī)分為四組:卵巢去勢(shì)組(OVX)、正常組(Normal)、他莫昔芬組(N+TAM)以及抗胰島素組(N+Anti)。對(duì)卵巢去勢(shì)組進(jìn)行雙側(cè)卵巢切除,正常組、他莫昔芬組和抗胰島素組進(jìn)行假手術(shù)(除不進(jìn)行卵巢切除,其余各步驟均與卵巢去勢(shì)組相同),術(shù)后恢復(fù)7天,各組利用腦立體定位儀進(jìn)行雙側(cè)海馬置管(bregma向后3.60mm,正中線兩側(cè)2.00mm,深度3.50mm)。海馬置管后恢復(fù)7天,即進(jìn)入正式實(shí)驗(yàn)。他莫昔芬組行為學(xué)連續(xù)訓(xùn)練5天,每天訓(xùn)練后立即給予腹腔注射10mg/kg他莫昔芬,用來(lái)阻斷雌激素受體β (ERβ),胰島素抗體組每天訓(xùn)練后立即給予雙側(cè)海馬內(nèi)注射胰島素抗體(2μl/side)。各組大鼠于行為學(xué)檢測(cè)前6h給予海馬注射2mMol的2-NBDG(2μl/side)。行為學(xué)測(cè)試后立即處死。取材:各組動(dòng)物處死前先采集腦脊液備用,后經(jīng)心臟采血,分離血清備用。各組動(dòng)物中一部分動(dòng)物(每組6只動(dòng)物)經(jīng)灌注、固定、連續(xù)冰凍切片,保存?zhèn)溆。各組動(dòng)物中另外一部分動(dòng)物(每組6只)立即斷頭取腦,分離雙側(cè)海馬,液氮冷凍備用。檢測(cè):行為學(xué)檢測(cè),利用智能水迷宮系統(tǒng),檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的變化。生化檢測(cè),利用ELISA技術(shù)檢測(cè)血清,腦脊液及海馬組織中胰島素水平;在腦的連續(xù)冠狀切片上,選取海馬平面(Bregma -3.30mm,-3.45mm,-3.60mm,-3.75mm,-3.90mm,-4.05mm),利用熒光顯微鏡觀察2-NBDG在海馬區(qū)的分布,并計(jì)數(shù)海馬CA3區(qū)2-NBDG陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量;提取海馬組織的總RNA,利用Q-RT-PCR技術(shù)檢測(cè)海馬組織胰島素mRNA的表達(dá)水平;提取海馬組織總蛋白,利用Western blotting檢測(cè)ERβ和GLUT4的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:1.卵巢去勢(shì)降低大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力:卵巢去勢(shì)后SD雌鼠出現(xiàn)明顯的空間學(xué)習(xí)記憶障礙;同時(shí),卵巢去勢(shì)組與正常組相比,海馬葡萄糖攝取顯著降低,海馬GLUT4蛋白表達(dá)水平明顯下降;海馬胰島素的mRNA和蛋白表達(dá)水平均降低。2.卵巢去勢(shì)對(duì)空間學(xué)習(xí)記憶的影響和雌激素受體p受體有關(guān):他莫昔芬阻斷ERp后,大鼠空間學(xué)習(xí)記憶出現(xiàn)明顯損害;同時(shí),他莫昔芬組的海馬葡萄糖攝取下降,海馬GLUT4蛋白表達(dá)水平降低,與正常組比;他莫昔芬組與正常組相比,海馬胰島素的mRNA和蛋白表達(dá)水平均下降。3.卵巢去勢(shì)對(duì)空間學(xué)習(xí)記憶的影響和海馬區(qū)胰島素水平及葡萄糖利用有關(guān):胰島素抗體中和海馬胰島素后,與正常組相比,空間學(xué)習(xí)記憶明顯損害,海馬葡萄糖攝取及海馬GLUT4蛋白表達(dá)水平顯著下降。結(jié)論:雌激素對(duì)海馬依賴性空間學(xué)習(xí)記憶的作用是通過(guò)雌激素受體p (ERβ)完成的:雌激素影響空間學(xué)習(xí)記憶的過(guò)程中有海馬胰島素信號(hào)的參與;在空間學(xué)習(xí)記憶過(guò)程中,雌激素通過(guò)影響海馬胰島素水平從而降低海馬葡萄糖代謝。
[Abstract]:Objective: menopause syndrome refers to women in the perimenopausal period due to a drop in estrogen levels caused by autonomic nerve function disorder a syndrome. The clinical findings of climacteric syndrome were associated with memory decline. The establishment of animal research model surgery more years in ovariectomized rats, tested by Morris water maze and fear conditioning behavior found, ovariectomy caused by low estrogen levels can damage the spatial learning and memory in ovariectomized rats; estrogen replacement therapy, can enhance the relationship between the hippocampal CA1-CA3 region of dendritic spines and LTP. female hormone and learning and memory, although there are a lot of reports, but the specific mechanism of estrogen is involved in information processing in the brain is still not clear. In addition, nerve the efficient use of energy system is the process of aerobic oxidation of glucose, the process of learning and memory with glucose utilization in specific regions of the brain The increase of the hippocampus is the key brain area for learning and memory tasks increase learning behavior of glucose in hippocampus in uptake based on the uptake of glucose into cells by cell membrane specific glucose transporter, glucose transporter has multiple subtypes, of which GLUT4 is widely distributed in skeletal muscle and adipose tissue, and has the characteristics of insulin the dependence of the expression of hippocampal nerve cells. In recent years GLUT4, suggesting that the hippocampal neural cells by glucose insulin signal. The insulin signaling and insulin sensitivity is affected by various signals, studies have observed that estrogen enhances insulin sensitivity, also found that estrogen can regulate insulin levels. Whether this kind of estrogen on insulin the role of information processing in the hippocampus still can make nothing of it. Therefore, in this study we by rats Construction of the low level of estrogen in ovariectomized model, observe the relationship between effects on hippocampal spatial memory and brain insulin signaling. Methods: Animal: female SD rats (weight 250g) were randomly divided into four groups: ovariectomy group (OVX), normal group (Normal), he (N+TAM) and tamoxifen group insulin resistance group (N+Anti). The ovariectomized group were ovariectomized, normal group, tamoxifen group and insulin resistance group (except the sham operation without ovariectomy, the rest of the steps are the same with the ovariectomized group), postoperative recovery after 7 days, each group of bilateral hippocampal catheter by stereotaxic instrument (bregma back 3.60mm, 2.00mm on both sides of the midline, the depth of 3.50mm). The hippocampus catheter after 7 days of recovery, namely into the formal experiment. The tamoxifen group behavior for 5 days of training, given intraperitoneal injection of 10mg/kg immediately after tamoxifen training every day, to block estrogen Hormone receptor beta (ER beta), bilateral intrahippocampal injection of insulin antibody immediately after training daily insulin antibody group (2 l/side). The rats in the behavioral test at 6h prior to 2mMol injection into the hippocampus of 2-NBDG (2 l/side) were killed. Immediately after the behavioral test. Materials: first acquisition of cerebrospinal fluid reserve in each group from before death, after the heart blood serum was isolated. A part of each animal in animal (6 in each animal) by perfusion, fixed, continuous frozen sections of each animal preservation reserve. The other part of the animal (n = 6) immediately decapitated, bilateral hippocampus, frozen in liquid nitrogen detection: standby. Behavioral testing, the use of intelligent water maze system, to detect the changes of learning and memory function in rats. Serum biochemical testing, using ELISA technology, the level of insulin in the hippocampus and cerebrospinal fluid; continuous coronal sections of brain hippocampus on the selected plane (B Regma -3.30mm, -3.45mm, -3.60mm, -3.75mm, -3.90mm, -4.05mm), the distribution of 2-NBDG by fluorescence microscopy in the hippocampus, and count the number of 2-NBDG positive cells in hippocampal CA3 area; extraction of total RNA in the hippocampus, the expression of insulin mRNA in the hippocampus of Q-RT-PCR technology; extraction of total protein in the hippocampus, the use of Western blotting detection of ER beta and GLUT4 protein expression levels. Results: 1. ovariectomized rats decreased the ability of spatial learning and memory: ovariectomized female SD rats appeared obvious spatial learning and memory disorder; at the same time, the ovaries castrated group compared with normal group, the hippocampus glucose uptake was significantly decreased, the protein expression of GLUT4 in hippocampus decreased level of expression; mRNA and insulin decreased.2. protein in hippocampus of ovariectomized memory effect associated with estrogen receptor P receptor on spatial learning: Tamoxifen blocked ERp, Obviously impaired memory of rats spatial learning; at the same time, tamoxifen group hippocampus glucose uptake decreased expression of GLUT4 protein level in the hippocampus decreased, compared with the normal group; the tamoxifen group compared with normal group, the expression of mRNA and protein in hippocampus of ovariectomized.3. insulin decreased level of insulin and glucose on spatial learning and memory and hippocampus use the insulin antibody and hippocampus after insulin, compared with the normal group, the spatial learning and memory damage, the expression level of GLUT4 protein in hippocampus and hippocampal glucose uptake decreased significantly. Conclusion: estrogen on the hippocampus dependent learning and memory space is the role of estrogen receptor P (ER beta) complete: insulin signaling in hippocampus the process of estrogen effects on spatial learning and memory; in the process of spatial learning and memory in the hippocampus by estrogen insulin Levels reduce glucose metabolism in the hippocampus.
【學(xué)位授予單位】:蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2014
【分類(lèi)號(hào)】:R711.75
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