本文選題：生殖器形成抑制基因-1　切入點：凋亡　出處：《鄭州大學》2017年碩士論文

【摘要】：卵巢癌是常見的一種婦科惡性腫瘤,有著很高的死亡率,目前對該病的治療主要是手術加化療,而化療耐藥使得該病治療效果并不樂觀。如今針對卵巢癌的研究雖然已經(jīng)有了很大的發(fā)展,但卵巢癌具體的發(fā)病機制仍不清楚,這給卵巢癌的防治工作帶來了極大的困難。作為一種實體性腫瘤,卵巢癌內(nèi)部存在著一定程度的缺氧,缺氧微環(huán)境對腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著重要的影響,這種影響在腫瘤細胞的凋亡、侵襲、遷移等一系列生物學行為上都已有研究。因此以缺氧的卵巢癌細胞為研究對象對卵巢癌相關生物學行為進行研究更能貼近腫瘤細胞在體內(nèi)的真實情況,具有不可忽視的重要意義。生殖器形成抑制基因-1(suppressor of morphogenesis in genitalia-1,SMG-1)是在無義介導的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)途徑中被廣泛研究的重要調(diào)節(jié)因子,該途徑可降解包含過早終止密碼子的mRNA來防止具有潛在毒性的截短蛋白的產(chǎn)生。SMG-1同時也是磷脂酰肌醇激酶相關激酶(phosphatidylinositol 3-kinase-related kinase,PIKK)家族成員之一,同其他PIKK蛋白激酶一樣,SMG-1在DNA損傷應激反應中發(fā)揮作用,從而維持基因組的穩(wěn)定性。除此之外SMG-1還參與到氧化應激反應、缺氧、細胞增殖及凋亡等多個生物進程中,甚至可以調(diào)控腫瘤的生長,目前已有多項研究將其引入腫瘤領域。信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子,在很多人類腫瘤中可被持續(xù)性激活,形成p-STAT3,p-STAT3可形成二聚體,從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細胞核,從而對一系列的基因表達進行調(diào)控,發(fā)揮生物學功能。STAT3是許多致癌相關信號通路的匯聚點,可控制若干促炎性細胞因子和生長因子的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路。在人卵巢癌細胞中可發(fā)現(xiàn)異常激活的STAT3,該異�；罨癄顟B(tài)的STAT3可對卵巢癌細胞的增殖及凋亡產(chǎn)生影響。目的本研究采用qRT-PCR、Western blot的方法檢測缺氧狀態(tài)下的卵巢癌細胞中SMG-1的表達情況及抑制該基因后STAT3的表達及活化情況,用流式細胞術和CCK-8檢測抑制SMG-1基因后對缺氧卵巢癌細胞凋亡、增殖情況的影響,來探究缺氧條件下SMG-1的表達以及沉默SMG-1基因?qū)θ毖鯛顟B(tài)卵巢癌細胞凋亡和STAT3、p-STAT3表達的影響。材料和方法1研究對象本研究選用人卵巢癌SKOV3細胞系(購自American Type Culture Collection),在37℃、5%CO_2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中,用RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)進行培養(yǎng)。2方法本研究使用RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)培養(yǎng)SKOV3細胞,待細胞對數(shù)生長期時開始種板進行后續(xù)試驗。2.1缺氧實驗分組及處理將對數(shù)生長期的SKOV3細胞經(jīng)0.25%胰酶消化后以1.0×105密度接種于六孔板中,細胞長滿50%-60%時開始缺氧處理。細胞分為常氧組和缺氧組。缺氧組加入氯化鈷(終濃度150μmol/L),常氧組不作處理。48h后分別提取總mRNA和總蛋白,首先通過Western blot方法對缺氧效果進行驗證,缺氧后HIF-1α蛋白表達量與未缺氧組細胞相比明顯升高(P0.05)為缺氧成功。然后采用qRT-PCR和Western blot方法對兩組細胞進行SMG-1 mRNA和蛋白表達水平的檢測。2.2轉(zhuǎn)染實驗分組及處理將對數(shù)生長期的SKOV3細胞經(jīng)0.25%胰酶消化后以1.0×105密度接種于六孔板中,用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng),待細胞貼壁后加入氯化鈷(終濃度150μmol/L)進行缺氧,缺氧24h后進行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染參照Lipofectamine2000說明書進行。轉(zhuǎn)染實驗分為四組。A組為空白對照,不加siRNA和Lipofectamine2000;B組加入陰性對照siRNA和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000;C組加入轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000;D組加入SMG-1 siRNA和Lipofectamine2000。轉(zhuǎn)染6h后更換完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清及150μmol/L氯化鈷),恒溫箱繼續(xù)培養(yǎng)48h后經(jīng)qRT-PCR和Western blot方法分別在mRNA和蛋白水平對SMG-1 siRNA沉默效果進行驗證,D組SMG-1表達量與A、B、C組相比有顯著性差異(P0.05)且D組與A組相比SMG-1表達抑制率大于50%可判定SMG-1基因被有效沉默。之后對A、B、C、D四組細胞分別進行凋亡率檢測(采用流式細胞術)和增殖抑制率檢測(采用CCK-8的方法),并提取總RNA和總蛋白,采用qRT-PCR和Western blot實驗分別檢測四組細胞中STAT3 mRNA相對表達水平和STAT3、p-STAT3蛋白表達水平。3統(tǒng)計學處理本研究采用SPSS21.0軟件對所得到的實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析,計量資料均以(?)±s來表示。兩組數(shù)據(jù)之間的分析比較采用兩獨立樣本t檢驗,多組數(shù)據(jù)之間的比較采用單因素方差分析。以α=0.05為檢驗水準。結(jié)果1缺氧處理后SKOV3細胞SMG-1mRNA和蛋白的表達1.1缺氧處理后SKOV3細胞SMG-1mRNA的相對表達水平缺氧組SKOV3細胞中SMG-1 mRNA相對表達水平為4.19±0.94,常氧組SMG-1 mRNA相對表達水平為1.12±0.17,缺氧組與常氧組相比SMG-1 mRNA表達水平明顯升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。1.2缺氧處理后SKOV3細胞中SMG-1蛋白表達水平缺氧組SKOV3細胞中SMG-1蛋白表達水平為0.58±0.11,常氧組SMG-1蛋白表達水平為0.26±0.06,缺氧組與常氧組相比SMG-1蛋白表達水平明顯升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2缺氧狀態(tài)下抑制SMG-1后SKOV3細胞凋亡情況流式細胞術檢測結(jié)果顯示,A組細胞凋亡率為(5.7±1.22)%,B組細胞凋亡率為(6.6±0.87)%,C組細胞凋亡率為(6.9±1.35)%,D組細胞凋亡率為(10.2±0.70)%。D組細胞與A組、B組、C組相比凋亡率明顯升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3缺氧狀態(tài)下抑制SMG-1后SKOV3細胞增殖情況CCK-8檢測結(jié)果顯示,A組作為參照,細胞增殖抑制率為0%。B組細胞增殖抑制率為(22.54±5.74)%、C組為(22.56±1.11)%、D組為(42.17±5.03)%,D組與B組、C組相比細胞增殖抑制率明顯升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4缺氧狀態(tài)下抑制SMG-1后SKOV3細胞中SMG-1和STAT3 mRNA的表達4.1缺氧狀態(tài)下抑制SMG-1后SKOV3細胞中SMG-1 mRNA的表達熒光定量PCR結(jié)果顯示,SKOV3細胞中SMG-1 mRNA的表達水平A組為1.00±0.07,B組為1.02±0.13,C組為0.88±0.07,D組為0.46±0.04。D組細胞中SMG-1 mRNA的表達水平與A組、B組和C組相比明顯降低,經(jīng)統(tǒng)計學處理分析差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.2缺氧狀態(tài)下抑制SMG-1后SKOV3細胞中STAT3 mRNA的表達熒光定量PCR結(jié)果顯示,SKOV3細胞中STAT3 mRNA的表達水平A組為1.00±0.05,B組為0.98±0.10,C組為0.86±0.04,D組為0.68±0.08。D組細胞中STAT3 mRNA的表達水平與A組、B組和C組相比明顯降低,經(jīng)統(tǒng)計學處理分析差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。5缺氧狀態(tài)下抑制SMG-1后SKOV3細胞中SMG-1、STAT3和p-STAT3蛋白的表達5.1缺氧狀態(tài)下抑制SMG-1后SKOV3細胞中SMG-1蛋白的表達Western blot結(jié)果顯示,SKOV3細胞中SMG-1蛋白表達水平A組為0.38±0.06,B組為0.37±0.06,C組為0.38±0.03,D組為0.16±0.04。D組細胞中SMG-1蛋白表達水平與A組、B組和C組相比明顯降低,經(jīng)統(tǒng)計學處理分析差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。5.2缺氧狀態(tài)下抑制SMG-1后SKOV3細胞中STAT3蛋白的表達Western blot結(jié)果顯示,SKOV3細胞中STAT3蛋白表達水平A組為0.59±0.05,B組為0.63±0.05,C組為0.71±0.05,D組為0.46±0.03。D組細胞中STAT3蛋白表達水平與A組、B組和C組相比明顯降低,經(jīng)統(tǒng)計學處理分析差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。5.3缺氧狀態(tài)下抑制SMG-1后SKOV3細胞中p-STAT3蛋白的表達Western blot結(jié)果顯示,SKOV3細胞中p-STAT3蛋白表達水平A組為0.56±0.03,B組為0.62±0.04,C組為0.61±0.04,D組為0.34±0.02。D組細胞中p-STAT3蛋白表達水平與A組、B組和C組相比明顯降低,經(jīng)統(tǒng)計學處理分析差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論缺氧可影響SMG-1表達水平;抑制SMG-1可影響STAT3的表達及活化,從而共同參與低氧SKOV3細胞凋亡進程。
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【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R737.31

【參考文獻】

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1 張展;杜尚珂;岳寧;石瑛;張琳琳;劉麗莎;賈莉婷;于海洋;;沉默生殖器形成抑制基因-1對JAR細胞凋亡及轉(zhuǎn)錄激活子3表達研究[J];中國婦幼保健;2015年33期

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本文編號：1712263