本文選題：MDH2　切入點：PTEN　出處：《南京醫(yī)科大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：子宮內(nèi)膜癌是威脅婦女健康的三大生殖道腫瘤之一。在北美和北歐,子宮內(nèi)膜癌是最常見的女性生殖道惡性腫瘤,占每年新發(fā)腫瘤病例的6%,腫瘤死亡病例的3%。子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率呈現(xiàn)明顯的地域性,發(fā)病率最高的是北美和北歐,其次為東歐和拉丁美洲,發(fā)病率最低的是亞洲和非洲。早期子宮內(nèi)膜癌總體生存率在74-91%,而晚期僅為20-26%。按照臨床表現(xiàn),病理學特征及預(yù)后等,子宮內(nèi)膜癌可以分為兩類,Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌通常以內(nèi)膜樣腺癌為主,由內(nèi)膜增生發(fā)展而來,常發(fā)生于生育年齡及絕經(jīng)后婦女,被認為與無拮抗的雌激素暴露相關(guān),Ⅰ型內(nèi)膜癌預(yù)后較好;Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌以漿液性癌或透明細胞癌為代表,通常由萎縮內(nèi)膜發(fā)展而來,多發(fā)生于絕經(jīng)后婦女,是非雌激素依賴型,預(yù)后差。雌激素在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機制中扮演著重要角色。無拮抗的雌激素暴露被公認為是Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌的重要風險因素。大樣本研究也已證實,無論Ⅰ型還是Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌,腫瘤組織中雌激素含量都高于正常組織。經(jīng)典的雌激素代謝理論認為,雌激素通過與細胞核的雌激素受體ER結(jié)合激活轉(zhuǎn)錄因子和下游信號通路發(fā)揮生理學效應(yīng),這個過程通常需要數(shù)小時。事實上,雌激素還可以通過與細胞膜上的G蛋白偶聯(lián)受體GPR30結(jié)合啟動僅耗時數(shù)分鐘甚至數(shù)秒鐘的快速雌激素信號通路。我們之前的研究中已經(jīng)證實,雌激素可以通過與GPR30的結(jié)合激活MAPK途徑促進子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖侵襲。分子生物學研究揭示了雌激素在促進子宮內(nèi)膜癌進展的生物學活動中PTEN,PIK3CA,K-RAS,P53,P16等基因突變或失活以及微衛(wèi)星不穩(wěn)定現(xiàn)象等的作用。研究表明,PI3K-AKT-PTEN-mTOR,Wnt-β-catenin等信號通路對子宮內(nèi)膜癌細胞的生存與增殖,基因的轉(zhuǎn)錄與表達起到重要的調(diào)節(jié)作用。而腫瘤抑制因子PTEN在幾乎高達80%的子宮內(nèi)膜腺癌,近55%的子宮內(nèi)膜增生過長病例中存在突變或失活。諸多研究數(shù)據(jù)提示,PTEN基因的突變是子宮內(nèi)膜癌病變早期的致病因素之一。80多年前,Otto Warburg提出了瓦氏效應(yīng),開啟了腫瘤代謝研究的新紀元。瓦氏效應(yīng)指出,即使在氧供充足的情況下,腫瘤細胞仍優(yōu)先選擇糖酵解的方式提供能量。眾所周知,有氧氧化可將一分子葡萄糖完全轉(zhuǎn)化為二氧化碳和水,同時產(chǎn)生34分子ATP;而糖酵解途徑在生成乳酸的同時,僅產(chǎn)生2分子ATP。腫瘤細胞選擇這種產(chǎn)能效率低的代謝方式的現(xiàn)象引起了人們的思考。Warburg認為腫瘤細胞線粒體功能的損傷使其不得不選擇糖酵解途徑產(chǎn)能。然而,數(shù)十年來,越來越多的研究數(shù)據(jù)顯示,大多數(shù)腫瘤細胞的線粒體功能并未受損,不僅如此,腫瘤細胞的線粒體中還發(fā)生了代謝重編程。在重編程過程中,代謝酶對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起到了重要的作用。它們發(fā)揮自身酶的催化作用,或是發(fā)生基因突變,亦或通過抑制細胞的死亡途徑等提高腫瘤細胞酵解途徑的代謝活性,促進腫瘤細胞的增殖侵襲。近年來一些研究顯示,部分代謝酶不僅可以發(fā)揮酶的催化作用,還可以作為一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子直接調(diào)控腫瘤抑制基因,從而影響腫瘤細胞的生物學行為。蘋果酸脫氫酶是三羧酸循環(huán)中的重要代謝酶。MDH催化蘋果酸與草酰乙酸的相互轉(zhuǎn)化。事實上,真核生物中,MDH通常有兩種亞型,MDH1和MDH2。MDH2參與線粒體TCA循環(huán),而MDH1通常參與蘋果酸-天冬氨酸穿梭。MDH在多種腫瘤組織中過表達,如分化較差的消化系統(tǒng)鱗狀細胞癌,惡性副神經(jīng)節(jié)瘤,前列腺癌等。MDH在腫瘤組織中表達上調(diào),活性增加,通過提高癌細胞代謝率發(fā)揮促進癌細胞的增殖的作用。有趣的是,一項關(guān)于MDH1與腫瘤抑制因子p53的關(guān)系的研究結(jié)果顯示,在無葡萄糖的環(huán)境下,MDH1通過與下游基因啟動子的P53反應(yīng)元件相互作用反式激活抑癌基因P53的活性。敲除MDH1可顯著降低乙酰-p53轉(zhuǎn)錄激活組蛋白編碼與啟動子結(jié)合。而且,MDH1還調(diào)節(jié)p53依賴的細胞周期停滯及凋亡�？梢�,MDH1可作為一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子調(diào)控抑癌基因的活動。本實驗希望通過科學研究探索蘋果酸脫氫酶MDH2與子宮內(nèi)膜癌抑制因子PTEN之間的關(guān)系,以及它們對腫瘤細胞生物學行為的影響,并初步探討雌激素膜受體GPR30在雌激素對MDH2和PTEN表達調(diào)節(jié)中的作用,為進一步研究子宮內(nèi)膜癌的能量代謝機制奠定基礎(chǔ)。實驗的第一部分,我們采用免疫組織化學法檢測子宮內(nèi)膜癌組織和正常組織MDH2表達情況及表達部位。同時,對臨床病理資料進行統(tǒng)計學分析,找出MDH2與子宮內(nèi)膜癌患者發(fā)病年齡,腫瘤的期別,級別,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等生物學特征之間的關(guān)系,以揭示MDH2的表達在子宮內(nèi)膜癌臨床病理方面的意義;第二部分,我們采用Realtime-PCR,Western-blot,細胞轉(zhuǎn)染,RNA干擾等方法研究MDH2和PTEN之間的相互影響,并用免疫熒光法直觀的展現(xiàn)MDH2與PTEN的表達部位與相互關(guān)系。第三部分,采用CCK8,流式細胞學分析,Transwell,凋亡檢測,細胞轉(zhuǎn)染,RNA干擾等方法,分別研究MDH2和PTEN對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖,侵襲,轉(zhuǎn)移及凋亡等生物學行為的影響;第四部分,采用Realtime PCR法,研究雌激素,GPR30激動劑和抑制劑對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖的影響。第一部分MDH2在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達及臨床病理意義對60孔子宮內(nèi)膜癌組織芯片進行蘇木素染色,結(jié)果顯示,子宮內(nèi)膜癌組織中,MDH2呈過表達狀態(tài),且其表達部位是細胞質(zhì)。對這34例子宮內(nèi)膜癌組織標本的臨床病理資料進行的統(tǒng)計學分析顯示MDH2的表達與子宮內(nèi)膜癌的級別相關(guān)。這些數(shù)據(jù)提示MDH2可能在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機制中發(fā)揮了重要作用。第二部分MDH2和PTEN間的相互關(guān)系構(gòu)建RNA干擾質(zhì)粒MDH2 RNAi敲減MDH2,從細胞水平和蛋白水平均檢測到PTEN表達的上升;而過表達質(zhì)粒GV219-MDH2則會使PTEN的表達水平下降。同樣的,用RNA干擾質(zhì)粒PTENRNAi敲減PTEN,MDH2在細胞水平和蛋白水平的表達都有所上升;而過表達質(zhì)粒GV219-PTEN則會使MDH2的表達下降。這些結(jié)果說明,MDH2和PTEN之間存在相互調(diào)節(jié)。免疫熒光檢測中,我們看到,MDH2和PTEN共同表達與子宮內(nèi)膜癌細胞HEC-1-A的細胞質(zhì)中。因此,二者很可能通過直接結(jié)合發(fā)揮相互調(diào)節(jié)作用,當然這一猜想還有待實驗進一步證實。第三部分MDH2和PTEN對子宮內(nèi)膜癌細胞生物學行為的影響構(gòu)建RNA干擾質(zhì)粒MDH2 RNAi及過表達質(zhì)粒GV219-MDH2,并分別轉(zhuǎn)染到子宮內(nèi)膜癌細胞系HEC-1-A和AN3CA中。結(jié)果顯示,敲減MDH2抑制了子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖,侵襲和轉(zhuǎn)移,促進了腫瘤細胞的凋亡;而過表達MDH2的子宮內(nèi)膜癌細胞系A(chǔ)N3CA卻表現(xiàn)出增殖,侵襲和轉(zhuǎn)移增強而凋亡減弱的情況。由此可見,MDH2促進子宮內(nèi)膜癌的增殖侵襲,抑制其凋亡。類似的,我們再分別構(gòu)建RNA干擾質(zhì)粒PTEN RNAi和過表達質(zhì)粒GV219-PTEN并轉(zhuǎn)染內(nèi)膜癌細胞,結(jié)果顯示,敲減PTEN后,子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖,侵襲和轉(zhuǎn)移的水平上調(diào),而凋亡卻受到抑制;相應(yīng)的,過表達PTEN后,內(nèi)膜癌細胞增殖侵襲減弱,凋亡增強。這也再次證實了 PTEN作為腫瘤抑制因子阻礙子宮內(nèi)膜癌細胞生存侵襲的作用。第四部分雌激素對MDH2和PTEN表達的影響用雌激素,GPR30激動劑G1和抑制劑G15分別刺激子宮內(nèi)膜癌細胞,在子宮內(nèi)膜癌細胞系HEC-1-A(ER陽性,GPR30陽性)和AN3CA(ER陰性,GPR30陽性)細胞系中,雌激素和G1刺激MDH2表達上升,而G15使MDH2表達下降。相反,雌激素和G1的刺激使PTEN表達下降而G15使其表達上升。由此,我們不難得出結(jié)論,雌激素對MDH2的表達上調(diào)及對PTEN的表達下調(diào),很可能是通過GPR30相關(guān)的信號通路完成的。綜上所述,MDH2很可能在雌激素的刺激下,通過GPR30相關(guān)的信號通路抑制PTEN的表達,發(fā)揮促進子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖侵襲的作用。MDH2與PTEN相關(guān)性的探索為子宮內(nèi)膜癌代謝機制的研究提供了實驗基礎(chǔ)。更為深入的實驗研究將揭示MDH2在子宮內(nèi)膜癌發(fā)病機制中的作用方式。MDH2很可能成為臨床上診斷治療子宮內(nèi)膜癌的新的靶點。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R737.33

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 何曉琳;錢慶;張澤;;腫瘤流行病學數(shù)據(jù)可視化分析[J];中華醫(yī)學圖書情報雜志;2016年01期

，

本文編號：1633127