本文選題：自噬通量　切入點(diǎn)：ATP　出處：《吉林大學(xué)》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：在卵巢癌的治療中,順鉑類(lèi)化療藥物仍是其一線藥物,并取得了一些治療效果。隨著順鉑在卵巢癌治療中的廣泛應(yīng)用,發(fā)現(xiàn)卵巢癌細(xì)胞逐漸對(duì)其產(chǎn)生耐受,這也是臨床卵巢癌治療的難點(diǎn)。順鉑主要是作用于細(xì)胞內(nèi)的DNA,導(dǎo)致DNA損傷,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯和凋亡。文獻(xiàn)報(bào)道,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬等細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)可能參與了卵巢癌等腫瘤的順鉑耐受。自噬能隔離細(xì)胞質(zhì)中的成分,并與溶酶體融合形成自噬溶酶體,降解細(xì)胞內(nèi)損傷的細(xì)胞器及堆積的蛋白質(zhì),為細(xì)胞代謝提供物質(zhì)。在正常的生理或者藥物刺激條件下,自噬保護(hù)腫瘤細(xì)胞免于化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。也有研究表明,過(guò)度或者持續(xù)的自噬導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。自噬在腫瘤細(xì)胞中可能發(fā)揮雙重作用,但其準(zhǔn)確的作用機(jī)制仍然存在爭(zhēng)議。自噬是溶酶體依賴(lài)的過(guò)程,并且在自噬末端需要與溶酶體融合形成自噬溶酶體,保障自噬通量順利進(jìn)行,同時(shí)自噬體與溶酶體的融合需要消耗大量溶酶體。隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)自噬可能參與了腫瘤細(xì)胞化療藥物如順鉑的耐受。而溶酶體功能與數(shù)量的維持對(duì)自噬通量是至關(guān)重要的,因此我們推測(cè)自噬-溶酶體可能與腫瘤細(xì)胞的化療藥物耐受有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)在溶酶體內(nèi)含有豐富的ATP,由于溶酶體也是細(xì)胞的降解中心,其腔內(nèi)較低的p H環(huán)境和水解酶對(duì)溶酶體的降解功能至關(guān)重要,而ATP可為溶酶體內(nèi)酸性環(huán)境和其內(nèi)水解酶活性提供所需的能量。具有較低p H的溶酶體腔是溶酶體內(nèi)水解酶活化的最佳環(huán)境,V-ATP酶對(duì)溶酶體酸性環(huán)境的維持具有重要作用,而V-ATP酶蛋白質(zhì)復(fù)合物功能的維持需要ATP提供能量。溶酶體內(nèi)部分水解酶的高表達(dá)也與腫瘤有關(guān),尤其是惡性腫瘤中常高表達(dá)Cathepsin D;若其缺陷可誘導(dǎo)細(xì)胞死亡;而Cathepsin D在溶酶體內(nèi)發(fā)揮活性需要ATP為其提供能量。溶酶體功能受損時(shí),降低自噬溶酶體的功能,甚至影響自噬溶酶體融合,嚴(yán)重時(shí)溶酶體內(nèi)的水解酶可被釋放至細(xì)胞質(zhì)中,觸發(fā)細(xì)胞凋亡。我們推測(cè)減少溶酶體內(nèi)ATP可能會(huì)導(dǎo)致溶酶體功能受損,降低自噬溶酶體功能,影響自噬通量,因而溶酶體內(nèi)ATP可能是調(diào)控腫瘤細(xì)胞化療藥物耐受的重要決定因素。本研究以人卵巢癌細(xì)胞SKOV3細(xì)胞(親代)和SKOV3/DDP細(xì)胞(順鉑耐受)為研究對(duì)象,基于ATP調(diào)控溶酶體探討自噬通量在卵巢癌順鉑耐藥的作用及機(jī)制,為腫瘤化療藥物耐受的治療提供新的策略。方法:⑵MTT法檢測(cè)順鉑對(duì)人卵巢癌SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞存活率的影響。⑵順鉑處理人卵巢癌SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞后,通過(guò)Western blot檢測(cè)Cleaved Caspase-3,p62,LC3,LAMP1,Cathepsin D表達(dá);間接免疫熒光方法觀察p62與LC3或Ub的共定位。⑶利用激光共聚焦顯維鏡觀察SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞中LTR著色的變化,和LAMP1與LC3共定位。⑷利用Cathepsin D活性試劑盒,檢測(cè)SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞中Cathepsin D活性的改變。⑸利用自噬抑制劑3-MA或CQ,抑制自噬后,MTT法檢測(cè)SKOV3/DDP細(xì)胞存活率的變化;通過(guò)Western blot檢測(cè)p62,LC3,Ub,Bcl-2,Bax,Cleaved Caspase-3,Cathepsin D和t Bid的表達(dá);激光共聚焦顯維鏡觀察LAMP1與LC3共定位,LTR著色的變化;Cathepsin D活性試劑盒檢測(cè)Cathepsin D活性的改變;流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量細(xì)胞凋亡率。⑹Cathepsin D活性抑制劑Pep A抑制Cathepsin D活性后,Western blot檢測(cè)p62,LC3和Ub的表達(dá);Cathepsin D活性試劑盒檢測(cè)Cathepsin D活性變化;間接免疫熒光的方法檢測(cè)LAMP1與LC3共定位。⑺利用激光共聚焦顯微鏡,通過(guò)Quinacrine染色檢測(cè)細(xì)胞中溶酶體內(nèi)ATP;利用DIDS抑制溶酶體內(nèi)ATP聚集,通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察LTR染色的變化;Western blot檢測(cè)p62和LC3表達(dá);間接免疫熒光的方法檢測(cè)LAMP1與LC3共定位。結(jié)果1.與SKOV3細(xì)胞相比,SKOV3/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑相對(duì)不敏感;順鉑可以誘導(dǎo)SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞LC3-II表達(dá)增加;與SKOV3細(xì)胞相比,順鉑作用SKOV3/DDP細(xì)胞12h時(shí),LC3-II蛋白表達(dá)較高,同時(shí)間接免疫熒光也觀察到大量點(diǎn)聚集的p62和LC3共定位,提示順鉑可以誘導(dǎo)SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞發(fā)生自噬,相比SKOV3細(xì)胞,SKOV3/DDP細(xì)胞中自噬水平較高。2.與SKOV3細(xì)胞相比,在SKOV3/DDP細(xì)胞中,無(wú)論有無(wú)順鉑處理,溶酶體膜標(biāo)志蛋白LAMP1及溶酶體內(nèi)Cathepsin D表達(dá)較高;且順鉑誘導(dǎo)SKOV3/DDP細(xì)胞溶酶體內(nèi)LTR著色增強(qiáng),Cathepsin D活性增高。3.與自噬抑制劑3-MA和順鉑聯(lián)合應(yīng)用相比,靶向溶酶體的自噬抑制劑CQ與順鉑的聯(lián)合應(yīng)用更加明顯地減少SKOV3/DDP細(xì)胞的存活率,引起LC3-II,p62和泛素化蛋白表達(dá)增加,減弱細(xì)胞內(nèi)LTR著色,降低Cathepsin D活性,甚至發(fā)生線粒體途徑凋亡。4.在SKOV3/DDP細(xì)胞中,Cathepsin D活性抑制劑Pep A和順鉑的聯(lián)合,明顯地降低了Cathepsin D活性,減弱LTR著色,同時(shí)也上調(diào)了p62,LC3-II和泛素化蛋白的表達(dá)水平。5.相對(duì)SKOV3細(xì)胞,SKOV3/DDP細(xì)胞中含有更加豐富的ATP;DIDS抑制SKOV3/DDP細(xì)胞的溶酶體內(nèi)ATP聚集后,明顯地減少了細(xì)胞中溶酶體內(nèi)ATP的含量,同時(shí)上調(diào)了p62和LC3-II蛋白的表達(dá),增加了LAMP1和LC3的共定位,減弱了LTR著色,降低Cathepsin D活性。結(jié)論:1.順鉑能夠誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生自噬,相對(duì)于SKOV3細(xì)胞,SKOV3/DDP細(xì)胞中自噬水平較高;與SKOV3細(xì)胞相比,在SKOV3/DDP細(xì)胞中,無(wú)論有無(wú)順鉑處理,溶酶體膜標(biāo)志蛋白LAMP1及溶酶體內(nèi)Cathepsin D表達(dá)較高;順鉑誘導(dǎo)SKOV3/DDP細(xì)胞溶酶體內(nèi)LTR著色增強(qiáng)和Cathepsin D活性升高,說(shuō)明相對(duì)SKOV3細(xì)胞,SKOV3/DDP細(xì)胞內(nèi)含有較豐富的溶酶體和Cathepsin D,這些結(jié)果提示自噬-溶酶體途徑可能與卵巢癌細(xì)胞的順鉑耐受有關(guān)。2.靶向溶酶體的自噬抑制劑CQ與順鉑的聯(lián)合應(yīng)用比早期階段自噬抑制劑3-MA和順鉑聯(lián)合應(yīng)用,更加明顯地減少SKOV3/DDP細(xì)胞的存活率,增加p62,LC3-II和泛素化蛋白的表達(dá),減弱LTR著色和降低Cathepsin D活性,引起自噬溶酶體的蓄積,甚至觸發(fā)線粒體途徑凋亡,說(shuō)明通過(guò)干擾溶酶體功能而抑制自噬通量增加了SKOV3/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性,提示自噬保護(hù)卵巢癌細(xì)胞免于順鉑誘導(dǎo)的凋亡,而且溶酶體可能通過(guò)調(diào)控自噬通量參與卵巢癌的順鉑耐受。3.相對(duì)SKOV3細(xì)胞,SKOV3/DDP細(xì)胞中含有較豐富的Cathepsin D;抑制溶酶體內(nèi)Cathepsin D的活性,可增加自噬相關(guān)蛋白p62,LC3-II的表達(dá),降低溶酶體內(nèi)LTR著色和Cathepsin D活性,提示溶酶體內(nèi)Cathepsin D可能通過(guò)維護(hù)溶酶體的降解功能保障自噬通量,參與卵巢癌的順鉑耐受。4.對(duì)比SKOV3細(xì)胞,SKOV3/DDP細(xì)胞的溶酶體內(nèi)含有較豐富的ATP,DIDS抑制SKOV3/DDP細(xì)胞的溶酶體內(nèi)ATP聚集,明顯地增加了自噬相關(guān)蛋白的表達(dá),降低溶酶體內(nèi)LTR著色和Cathepsin D活性,甚至引起自噬溶酶體蓄積,提示減少溶酶體內(nèi)ATP不僅影響溶酶體,也可能干擾自噬溶酶體的降解功能,進(jìn)而調(diào)控自噬通量參與卵巢癌細(xì)胞的順鉑耐受。本實(shí)驗(yàn)首次通過(guò)ATP調(diào)控溶酶體探討自噬通量在卵巢癌順鉑耐藥中的作用及機(jī)制,為克服腫瘤細(xì)胞化療藥物耐受提供新的策略。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R737.31

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本文編號(hào)：1595201