本文關鍵詞： 皮秒脈沖電場 宮頸癌動物模型 凋亡 有效性 安全性　出處：《重慶醫(yī)科大學》2014年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，嚴重威脅婦女的身心健康。宮頸癌現有的治療方式已經比較成熟，然而都不同程度的影響了患者的生育能力或正常組織器官的功能。近年來，宮頸癌患者的發(fā)病年齡逐漸出現年輕化趨勢，而年輕患者保留生育功能的愿望更為迫切。因此，尋求更多可抑制或殺傷腫瘤，同時減少創(chuàng)傷的治療手段成為目前宮頸癌治療的研究熱點。 脈沖電場(Pulsed Electric Fields, PEF)的出現備受生物醫(yī)學領域學者的關注。前期研究表明，當微秒級和納秒級脈沖電場作用于腫瘤細胞后，可以產生協(xié)同化療藥物殺傷腫瘤細胞的生物學效應，甚至可以直接殺傷腫瘤細胞，為腫瘤應用脈沖電場治療奠定了基礎。然而，微秒級和納秒級的脈沖電場在治療腫瘤時，需通過電極針為載體才能達到治療部位發(fā)揮作用。這種方法在一定程度上限制了脈沖電場在臨床的應用。如果脈沖電場可以克服這個缺點，能無創(chuàng)引導進入患者體內，那么脈沖電場在臨床的應用才能更為廣泛和可行。因此，具有穿透性及靶向性的皮秒脈沖電場（Picosecond pulsed electric fields，psPEF）本課題由國家自然科學基金面上項目(81172123)資助為腫瘤的治療提供了新的思路，目前國內外關于psPEF治療腫瘤的相關研究較少。根據脈沖電場對細胞作用的窗口效應及微秒脈沖的電穿孔效應和納秒脈沖的細胞內處理效應，從理論上講，脈寬較低的皮秒級脈沖電場對細胞的主要作用應該在細胞器水平，而線粒體和內質網等細胞器與細胞凋亡的發(fā)生密切相關。另外皮秒脈沖電場還具有以下優(yōu)點：高時間分辨率、高空間分辨率、在傳播過程中保持輸入脈沖的沖激特性、在靶點區(qū)域具有很高的分辨率。匹配超寬帶沖激脈沖輻射天線（Impulse radiating antenna，IRA）所產生的皮秒脈沖電場可以向指定的范圍傳輸能量，將脈沖電磁波匯聚于目標組織，甚至可以使靶點組織發(fā)生壞死。在傳播過程中IRA的輻射能量在空間、時間上都很集中。如果能夠利用IRA將皮秒脈沖電場輸送進入腫瘤組織，便有可能實現腫瘤的無創(chuàng)治療。本課題組在前期的研究中發(fā)現皮秒脈沖電場可誘發(fā)Hela細胞內線粒體膜電位變化，通過內質網應激途徑活化caspases（Cysteine-containing aspartate-specific proteases，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶類）依賴的細胞凋亡途徑而誘導Hela細胞凋亡，而體內腫瘤細胞的活動受神經、體液等多方面因素的影響，因此，有必要在細胞學研究水平的基礎上進行動物實驗，進一步研究皮秒脈沖電場對宮頸癌模型動物在體腫瘤的治療機制是否同樣是誘導腫瘤細胞凋亡，并觀察其治療的有效性和安全性，研究結果對于其臨床應用的進一步研究具有指導意義。 本課題構建裸鼠宮頸癌動物模型作為在體實驗的研究對象，以前期細胞實驗為基礎，對皮秒脈沖電場治療宮頸癌動物模型的機制及有效性安全性進行初步研究，目的是為皮秒脈沖電場治療宮頸癌的可行性及進一步臨床應用研究提供較為直接的依據。研究共分為三部分。 第一部分皮秒脈沖電場治療宮頸癌動物模型誘導凋亡機制的研究 第一節(jié)裸鼠宮頸癌動物模型的構建 目的：構建裸鼠宮頸癌荷瘤動物模型。 方法：將制備好的Hela細胞懸液接種于裸鼠背部皮下,每鼠0.2ml。1周后可捫及皮下結節(jié)，大約需2周待腫瘤最大直徑約0.5-0.8cm時,取腫瘤組織作移植瘤模型，約2周移植瘤直徑達1.0cm左右。將成功移植腫瘤的荷瘤小鼠按實驗設計要求分為對照組、治療組。 結果：成功建立人宮頸癌荷瘤動物模型。 第二節(jié)皮秒脈沖電場治療宮頸癌動物模型適宜參數的篩選 目的：研究并篩選psPEF治療宮頸癌荷瘤動物模型的適宜參數。 方法：根據前期細胞實驗結果及預實驗結果設定參數并分為三個不同電壓作用的實驗組(50kV組，60kV組，70kV組)，固定參數為：脈沖個數2000個，脈寬800ps，頻率3Hz。使用鑷型電極無創(chuàng)傳導皮秒脈沖電場治療荷瘤動物模型，脈沖電場治療后24h處死動物，取腫瘤組織，采用TTC染色法染色腫瘤組織，測量并計算壞死腫瘤組織體積。根據統(tǒng)計結果篩選適宜的治療宮頸癌動物模型的皮秒脈沖電場參數。 結果：皮秒脈沖電場治療荷瘤動物模型腫瘤組織后，通過TTC染色法，可觀察到隨著電壓的增高，腫瘤組織呈蒼白色的區(qū)域逐漸增大。統(tǒng)計結果表明各電壓組壞死組織長徑、寬徑均無統(tǒng)計學差異；50kV組與60kV組壞死組織的厚度無差異；50kV組與70kV組壞死組織的厚度相比較有統(tǒng)計學差異(P0.05)；三組之間壞死組織體積相比較均有顯著統(tǒng)計學差異(P0.01)。 結論：皮秒脈沖電場治療宮頸癌動物模型后，隨著電壓增高，腫瘤組織的壞死程度逐漸加重。因此，皮秒脈沖電場治療宮頸癌動物模型的適宜參數為：脈沖個數2000個、脈寬800ps、頻率3Hz、電壓70kV。 第三節(jié)皮秒脈沖電場治療宮頸癌動物模型誘導凋亡機制的研究 目的：觀察皮秒脈沖電場治療宮頸癌動物模型的誘導凋亡效應，初步探討其誘導凋亡的機理。 方法：將宮頸癌動物模型分為四個組，即對照組和治療組(脈沖治療后6h組、脈沖治療后12h組、脈沖治療后24h組)，固定參數為：脈沖個數2000個，脈寬800ps，電壓70kV，頻率3Hz。使用鑷型電極無創(chuàng)傳導皮秒脈沖電場治療宮頸癌動物模型。應用HE染色法觀察腫瘤組織細胞形態(tài)學變化。采用透射電子顯微鏡觀察對照組和治療組腫瘤組織細胞的超微結構。TUNEL試劑盒檢測腫瘤細胞的凋亡率；激光共聚焦顯微鏡觀察腫瘤組織線粒體的跨膜電位變化；采用caspase-3，caspase-8，caspase-9，caspase-12活性測定試劑盒分別測定caspase-3，caspase-8，caspase-9，caspase-12的活性。 結果：組織細胞形態(tài)學結果顯示對照組腫瘤組織無明顯細胞壞死，而治療組均有細胞壞死，且隨治療后時間的延長壞死程度逐漸加重。透射電子顯微鏡觀察結果顯示對照組腫瘤細胞表現出輕微的線粒體腫脹，而治療后6h組腫瘤細胞出現早期凝固性壞死，治療后12h組出現顯著的凝固性壞死和多個凋亡小體，治療后24h組出現更為顯著的凝固性壞死和少量凋亡小體。TUNEL檢測腫瘤組織的細胞凋亡率結果表明，與對照組相比，各治療組的腫瘤細胞凋亡率顯著升高(P0.01)，治療后12h組的細胞凋亡率顯著高于其他治療組(P0.01)，治療后6h組與治療后24h組相比較無統(tǒng)計學差異。激光共聚焦顯微鏡下觀察各組線粒體跨膜電位的結果表明，從對照組到治療后6h組、治療后12h組，紅色熒光逐漸減弱，綠色熒光逐漸增強，但是治療后24h組兩種熒光均明顯減弱。試劑盒測定caspase-3，caspase-8，caspase-9，caspase-12活性結果顯示，治療組caspase-3和caspase-12的活性升高，各組caspase-3與caspase-12活性結果趨勢相似，均為治療后12h組治療后24h組治療后6h組=對照組，各組caspase-8和caspase-9活性無統(tǒng)計學差異。 結論：psPEF可使用鑷型電極引導至宮頸癌動物模型的腫瘤部位，殺傷腫瘤細胞，在此過程中線粒體膜電位下降及內質網應激途徑激活誘導腫瘤細胞凋亡發(fā)揮了作用。 第二部分皮秒脈沖電場治療宮頸癌動物模型的有效性研究 目的：觀察皮秒脈沖電場治療宮頸癌動物模型后腫瘤體積的變化、相對腫瘤增殖率及生存曲線。 方法：將宮頸癌動物模型分為對照組和治療組，皮秒脈沖電場的參數為：脈沖個數2000個，脈寬800ps，頻率3Hz，電壓：70kV。使用鑷型電極無創(chuàng)傳導皮秒脈沖電場治療宮頸癌動物模型。觀察裸鼠精神狀態(tài)及腫瘤組織的生長情況。每3天測量1次裸鼠的腫瘤體積。根據腫瘤體積測量的結果計算相對腫瘤增殖率。治療組和對照組的動物模型在同等條件下飼養(yǎng)，自然生存并記錄死亡時間，制作生存曲線。 結果：對照組與治療組腫瘤最早分別于第24天，第58天發(fā)生破潰。治療組腫瘤體積在治療后3天、6天、9天與對照組比較，經統(tǒng)計學分析有差異，12天以后無統(tǒng)計學差異。治療組相對腫瘤增殖率在治療后3天、6天、9天分別為76.87%、71%、68.87%。生存時間觀察顯示對照組為（41-92）天，治療組為（70-118）天。兩組荷瘤動物的生存曲線無統(tǒng)計學差異。 結論：提示皮秒脈沖電場治療宮頸癌動物模型腫瘤對其生長有抑制作用。但遠期抑制效應不明顯。 第三部分皮秒脈沖電場治療宮頸癌動物模型的安全性研究 第一節(jié)皮秒脈沖電場對宮頸癌動物模型腫瘤周圍組織的影響 目的：觀察皮秒脈沖電場對宮頸癌動物模型腫瘤周圍正常皮膚及皮下組織的影響。 方法：將宮頸癌動物模型分為四個組，即對照組和治療組(脈沖治療后6h組、脈沖治療后12h組、脈沖治療后24h組)，固定參數為：脈沖個數2000個，脈寬800ps，電壓70kV，頻率3Hz。使用鑷型電極無創(chuàng)傳導皮秒脈沖電場治療宮頸癌動物模型。取電極接觸部位的動物皮膚及皮下組織，采用HE染色觀察其組織細胞形態(tài)學變化，采用透射電子顯微鏡分別觀察對照組和治療組動物模型皮膚及皮下組織的超微結構，用DNAladder觀察有無凋亡現象。 結果：HE染色結果顯示，對照組及治療組的皮膚及皮下組織均無明顯壞死。透射電子顯微鏡觀察結果顯示對照組及治療組電極接觸部位的皮膚表皮和真皮層結構均無破壞，未見壞死。治療后6h組表皮纖維細胞結構正常，基底細胞線粒體輕度腫脹，血管內皮細胞正常。治療后12h組表皮纖維細胞正常，胞膜、核膜完整，細胞內線粒體腫脹。治療后24h組表皮結構正常，多泡脂肪細胞結構完整，血管結構正常，內皮細胞未見腫脹。對照組及治療組未見DNAladder條帶。 結論：皮秒脈沖電場治療宮頸癌動物模型后脈沖傳導所經過的皮膚及皮下組織未見細胞凋亡、損傷與壞死。 第二節(jié)皮秒脈沖電場治療對宮頸癌動物模型重要臟器的影響 目的：觀察皮秒脈沖電場治療對宮頸癌動物模型重要臟器的影響。 方法：將宮頸癌動物模型分為對照組和治療組，脈沖參數為：脈沖個數2000，，脈寬800ps，頻率3Hz，電壓70kV。使用鑷型電極無創(chuàng)傳導皮秒脈沖電場治療宮頸癌動物模型。脈沖治療后24h，采血并取裸鼠的心臟、肝臟、腎臟。分別采用乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒、谷丙轉氨酶(GPT)測定試劑盒、谷草轉氨酶(GOT)測定試劑盒、尿素氮(BUN)測定試劑盒測定心臟、肝臟及腎臟功能。采用HE染色觀察脈沖治療后荷瘤動物心臟、肝臟及腎臟的組織細胞形態(tài)學變化。 結果：皮秒脈沖電場治療組宮頸癌動物模型的心功能血清學指標LDH，肝功能血清學指標GOT和GPT及腎功能血清學指標BUN活性與對照組相比較無統(tǒng)計學差異。HE染色顯示治療組荷瘤動物模型的心臟、肝臟、腎臟的組織細胞形態(tài)結構正常。 結論：皮秒脈沖電場治療宮頸癌動物模型后，裸鼠的心臟、肝臟、腎臟的功能及形態(tài)無明顯改變，提示皮秒脈沖電場對裸鼠宮頸癌動物模型的重要臟器無影響。
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【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R737.33;R-332

【參考文獻】

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本文編號：1531740