本文關鍵詞： 卵巢癌 主動靶向性 物理靶向性 納米載體 葉酸　出處：《山東大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：在我國卵巢癌發(fā)病率位列于女性惡性腫瘤第五位,為女性病死率最高的疾病,卵巢癌嚴重危害女性健康。由于卵巢癌患者早期缺乏典型的癥狀和體征,因此絕大多數(shù)卵巢癌在確診時已屆晚期(FIGO III-IV期),患者的預后不良。晚期患者5年生存率不足400%。傳統(tǒng)上早期卵巢癌患者以手術切除為主;晚期上皮性卵巢癌標準一線治療方案是腫瘤細胞減滅術,新型輔助化療術以及術后卡鉑+紫杉醇聯(lián)合化療,但是約有70%以上的卵巢癌患者會復發(fā);對于卵巢癌復發(fā)及耐藥患者目前仍然缺乏有效的治療手段。化學治療是卵巢癌的主要輔助治療手段,然而盡管新型化療藥物和化療方案陸續(xù)投入臨床使用,近幾十年來患者的預后并未得到顯著的改善。因此,亟需一種新的有效的治療手段應用于臨床,以期提高療效改善患者預后。納米技術的發(fā)展為惡性腫瘤的靶向治療提供了新的思路,為卵巢癌的綜合治療提供了新的手段。納米科技從在20世紀90年代初興起到現(xiàn)在經(jīng)歷了飛速的發(fā)展,取得了令人矚目的成果。目前納米技術已經(jīng)廣泛的應用于航空航天、生物醫(yī)學、材料等多個領域。在醫(yī)藥領域方面,載藥納米載體的出現(xiàn)和發(fā)展,為靶向抗腫瘤藥物的研制提供了新的途徑。納米作為載體包裹難溶性藥物,可以增加藥物的溶解度,提高水溶性藥物的穩(wěn)定性,提高藥物的生物利用度,減少藥物的毒副作用。腫瘤組織生長迅速,大量新生血管產(chǎn)生,血管的通透性增加,同時腫瘤組織缺乏有效的淋巴引流,因此載藥納米載體對腫瘤組織具有增強的滲透性和滯留效應(EPR效應),從而達到對腫瘤組織的被動靶向及緩釋作用;腫瘤組織無氧酵解增加,腫瘤局部呈現(xiàn)酸性環(huán)境,使用PH敏感性的生物可降解材料制備的納米載體,使納米載體選擇性的在腫瘤部位降解釋放藥物,正常組織呈PH中性,因此納米載體在正常組織中保持穩(wěn)定,從而實現(xiàn)腫瘤的物理靶向性作用;將相應的配體或者是特異性的單克隆抗體與納米載體通過物理或者化學鍵的方式相耦聯(lián),依靠靶向分子特異性識別腫瘤細胞表面的受體或者配體,提高載藥納米載體對腫瘤組織的選擇性,減少載藥納米載體在周圍組織中的聚集,實現(xiàn)了納米載體的主動靶向性作用�；诩{米載體具有物理化學靶向性,被動靶向性和主動靶向性作用,載藥納米載體對于婦科腫瘤的診斷和治療提供了新的思路。本課題主要內(nèi)容以兩親性共聚物聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)-聚乳酸(Polylactic acid,PLA)為材料,連接具有主動靶向基團葉酸分子(Folic acid,FA),制備具有卵巢癌主動靶向性的納米載體膠束,將上述兩種納米粒作為載體包裹國產(chǎn)二代光敏劑竹紅菌乙素(HB),或者卵巢癌一線化療藥物紫杉醇,檢測納米粒徑,電位變化以及透射電鏡的納米形態(tài)檢測不同載藥納米載體的理化性質,納米膠束的毒性實驗和攝取實驗從細胞水平上驗證了該主動靶向性納米載體的低毒性和腫瘤靶向性特點,體內(nèi)藥物組織分布情況和藥代動力學證明了納米載體具有緩釋作用以及含有葉酸分子的載藥納米載體的主動靶向性特點;不同納米組的抗腫瘤效果進一步證明了葉酸納米載體的主動靶向性。本實驗系統(tǒng)的利用了納米載體的被動靶向性,物理PH靶向性,以及連接葉酸以后的主動靶向性充分證明了該載藥納米載體的緩釋作用和腫瘤靶向性的特點。第一部分納米嵌段PEG-PLA-NP和葉酸偶聯(lián)納米載嵌段PEG-PLA-FA-NP的制備及其理化性質的測定目的制備具有兩親性共聚物納米嵌段聚乳酸-聚乙二醇(PEG-PLA),在此納米嵌段氨基端偶聯(lián)葉酸分子制備具有腫瘤主動靶向性的聚乳酸-聚乙二醇(FA-PEG-PLA)納米嵌段,并對兩種不同的納米嵌段共聚物進行理化性質檢測,評估其后續(xù)研究可行性。方法利用純化的丙交酯在引發(fā)劑的作用下與環(huán)氧乙烷避光恒溫反應24h后酸解,抽濾干燥得到聚乙二醇-聚乳酸(H2N-PEG-b-PLA-MMA)嵌段共聚物分子。在PEG-PLA氨基端偶聯(lián)葉酸合成具有腫瘤靶向性的(FA-PEG-b-PLA-MMA)納米嵌段,FA-PEG-b-PLA-MMA是由已經(jīng)合成成功的PEG-PLA納米嵌段與葉酸在DCC和NHS的介導下反應24h,透析干燥得到磚紅色含有葉酸的納米嵌段。通過粒徑散射儀檢測不同納米嵌段的粒徑大小和電位變化,利用透射電鏡觀察納米粒的形態(tài)特點,核磁檢測兩種納米載體的H離子證明是否成功將葉酸連接到PEG-PLA納米嵌段上。結果成功制備PEG-PLA-NP和FA-PEG-PLA-NP兩種嵌段共聚物納米載體,兩種納米載體在透射電鏡下觀察,粒子呈球形,分散佳,粒徑均在100-200納米之間。PEG-PLA納米載體的平均粒徑為116.0nm,FA-PEG-PLA納米載體平均粒徑為124.Onm。核磁波譜顯示葉酸成功連接到納米嵌段上。結論成功制備了兩種納米嵌段共聚物,兩種納米嵌段載體性質穩(wěn)定,粒徑大小均勻,在120nm左右,納米粒呈球形分布,分散佳。為后續(xù)包裹不同的藥物提供了原材料。第二部分竹紅菌乙素(HB)納米載體的制備載藥納米載體理化性質性質檢測以及抗腫瘤效應以及淋巴靶向性目的制備竹紅菌乙素納米載體以及含有葉酸的竹紅菌乙素納米載體膠束并對其理化性質進行檢測,體內(nèi)體外實驗驗證葉酸受體靶向納米載體PEG-PLA-FA-NP對高表達葉酸受體的卵巢癌細胞系(SKOV3)或卵巢癌組織的主動靶向性作用,體外釋放實驗以及體內(nèi)的藥物組織分布實驗和藥代動力學實驗均驗證納米粒的緩釋作用。體外攝取實驗以及體內(nèi)腫瘤組織分布實驗驗證葉酸納米載體的腫瘤主動靶向性。方法本課題通過不斷優(yōu)化納米載體的制備,利用旋轉蒸發(fā)透析法成功制備了HB-PEG-PLA-NP以及HB-FA-PEG-PLA-NP兩種納米載體膠束并對其理化性質進行檢測。分別用透射電鏡以及動態(tài)光散射儀測得不同的納米膠束的形態(tài)特點,粒徑的大小以及納米膠束的電位情況。高效液相技術檢測兩種不同竹紅菌乙素納米載體膠束的包封率和載藥量以及納米膠束的體外釋放情況,利用RT-PCR技術檢測A2780,H08910,SKOV3三種不同卵巢癌細胞系中葉酸受體的表達情況,從而篩選出葉酸高表達細胞系,為后續(xù)實驗的研究提供了理論依據(jù)。MTT檢測不同納米載體的細胞毒性作用,細胞攝取實驗驗證帶有葉酸的納米載體可以更多的被腫瘤細胞所攝取。建立動物模型,分別靜脈注射不同劑型不同藥物含量的溶液,本別于不同時間點處死荷瘤小鼠,利用HPLC技術檢測不同組織中的HB含量,從而驗證納米的緩釋效應以及腫瘤靶向性作用。結果1.成功制備竹紅菌乙素納米膠束,透射電鏡檢測兩種納米膠束中納米粒呈球形,大小均勻,分散性好。HB-PEG-PLA-NP納米粒徑大小為137.8nm,Zate電位為-17.34mV,HB-FA-PEG-PLA-NP納米粒徑大小為145.9nm,Zate電位為-22.34mV.2.RT-PCR檢測SKOV3細胞的葉酸受體表達豐度明顯高于H08910和A2780細胞系。3.細胞的毒性實驗中,相同劑量下,單純HB溶液較兩種竹紅菌乙素載藥納米膠束溶液對于卵巢癌細胞系SKOV3的毒性弱,證明納米載體攜帶竹紅菌乙素可以提高藥物的殺傷作用,不同濃度納米嵌段共聚物PEG-PLA對卵巢癌細胞系SKOV3毒性較弱,證明該納米載體作為一種安全的有效的納米載體,具有臨床應用價值。細胞攝取實驗結果顯示攜帶葉酸的納米�？梢愿嗟谋荒[瘤細胞所攝取,由此證明,含有葉酸的納米載體對于腫瘤細胞具有靶向性的作用。3.體外釋放實驗,體內(nèi)藥物代謝動力學分布情況以及藥物組織分布情況均證明納米載體的緩釋效應。4.體外細胞攝取實驗以及體內(nèi)的藥物組織分布實驗均證明了腫瘤的靶向性作用。5.通過腹腔注射相同劑量的兩種載藥納米載體膠束和單純的竹紅菌乙素溶液,于不同時間點處死家兔,觀察家兔腸系膜淋巴結的變化,證明納米嵌段作為一種有效的藥物運輸系統(tǒng),具有淋巴結靶向性特點結論納米膠束粒徑大小均勻,性質穩(wěn)定并且低毒性和高效性可以應用于體內(nèi)抗腫瘤治療,葉酸修飾的嵌段納米共聚物對高表達葉酸的卵巢癌細胞和組織具有主動靶向性作用,葉酸受體介導的載藥納米載體可以使更多的藥物進入卵巢癌腫瘤細胞和卵巢癌組織中,從而促進光敏劑HB在一定波長的刺激下對腫瘤細胞和組織產(chǎn)生殺傷作用。不同濃度的PEG-PLA載體作用于SKOV3細胞,MTT實驗證明了 PEC-PLA納米載體嵌段具有低毒性和緩釋作用,可以作為藥物的載體應用于臨床。腹腔注射載藥納米載體后6h,家兔腸系膜淋巴結明顯的增大,體內(nèi)藥物的組織分布,淋巴結中,兩種納米組藥物含量較單純藥物組顯著增高,由此證明了納米載體具有淋巴靶向性特點。第三部分紫杉醇載藥納米粒的制備理化性質與體內(nèi)細胞學實驗目的制備紫杉醇納米載體膠束(PTX-PEG-PLA-NP和PTX-FA-PEG-PLA-NP)并對其理化性質進行檢測,MTT檢測不同紫杉醇納米載體膠束和單純紫杉醇溶液對于卵巢癌細胞SKOV3的毒性作用,從而印證納米嵌段作為一種有效的載體可以改善紫杉醇的低溶解性并且提高紫杉醇抗腫瘤效果,減少紫杉醇的毒副作用。細胞攝取進一步驗證葉酸作為特異性分子能與卵巢癌細胞表面葉酸受體特異性結合實現(xiàn)腫瘤的主動靶向性作用。體外釋放實驗驗證了載藥納米載體具有緩釋效應。方法1.成功制備紫杉醇納米膠束,透射電鏡檢測兩種納米膠束中納米粒呈球形,大小分布均勻,分散較好。PTX-PEG-PLA納米粒徑大小為128.8nm,Zate電位為-35.4mV,PTX-FA-PEG-PLA納米粒徑大小為143.6nm,Zate電位為-42.53mV.2.細胞的毒性實驗中,不同濃度的PEG-PLA-NP對于卵巢癌細胞的毒性隨著濃度的升高毒性逐漸增加,但是當濃度到100ug/ml時,對腫瘤細胞的毒性在80%以上,證明納米載體本身具有低毒性特點。單純PTX溶液比相同藥物含量的納米膠束溶液對于卵巢癌細胞的毒性弱,達到相同的抗腫瘤效果,納米載體組需要更少的藥物,該納米載體作為一種安全的納米載體具有臨床應用價值。3.細胞攝取實驗證明,卵巢腫瘤細胞攝取更多的含有葉酸的納米載體,證明了葉酸載藥納米載體具有腫瘤靶向性的作用。4.體外釋放實驗驗證納米載藥在體外具有緩釋效應,體內(nèi)藥物代謝動力學分布情況以及組織的藥物分布情況證明納米載體在體內(nèi)具有緩釋效應,納米載體的緩釋作用在體內(nèi)體外均得到了證實。結論納米膠束粒徑大小均勻,性質穩(wěn)定并且低毒性可以應用于體內(nèi),葉酸修飾的嵌段納米共聚物對高表達葉酸的卵巢癌細胞和組織具有靶向性,葉酸受體介導的納米載體使更多的紫杉醇進入腫瘤細胞和卵巢癌組織中,紫杉醇納米載體可以在體內(nèi)緩慢的釋放出紫杉醇,使紫杉醇在體內(nèi)發(fā)揮作用時間延長,減少紫杉醇的用量從而降低由于過度用藥帶來的藥物毒副反應。PEG-PLA具有低毒性和緩釋作用,因此該納米載體可以作為藥物的載體應用于臨床。葉酸偶聯(lián)的納米載體具有腫瘤靶向性作用,以及腫瘤高效的殺傷作用,從而具有臨床應用價值。第四部分紫杉醇的性質測定以及紫杉醇納米載體的抗腫瘤效果檢測目的紫杉醇不易溶于水,但是納米載體的應用解決了紫杉醇這一弊端,載藥納米載體可以將紫杉醇包裹在嵌段之中,提高了抗腫瘤的效果,為了進一步檢測不同藥物組中各個組織中的紫杉醇含量,建立了紫杉醇的高效液相(HPLC)檢測方法,以及皮下瘤裸鼠模型的建立。通過不同組靜脈注射藥物,觀察皮下腫瘤的大小以及裸鼠的體重,從體外動物的層面上進一步證實了載藥納米載體具有抗腫瘤效果,該實驗結果為紫杉醇用于卵巢癌的治療提供了新的思路。方法1.紫杉醇理化性質檢測(吸光度,標準曲線的制備,精密度實驗,HPLC方法的制定)2.紫杉醇在不同組織中藥物含量標準曲線的建立3.靜脈注射三種不同種類的藥物,于不同的時間點處死荷瘤小鼠,分別檢測不同組織中不同時間點的紫杉醇含量,從而得出藥物的組織分布情況。4.靜脈注射不同組藥物,分別測量皮下腫瘤的大小和荷瘤小鼠的體重,得出不同藥物組抗腫瘤效果。結論紫杉醇濃度在10-70ug/ml時吸光度呈現(xiàn)較好的線性關系,根據(jù)紫杉醇日內(nèi)和日間精密度結果證實紫杉醇性質較為穩(wěn)定。紫杉醇在流動相(V乙腈:V水=1:1,柱溫25℃,進樣量為1ml/min的條件下所得的HPLC的峰較好,不同濃度出峰時間較為固定。濃度在2.5-35ug/ml時,呈線性分布。紫杉醇濃度-峰面積標準曲線為Y=180.085X+93.195(r=0.997)。各個組織的紫杉醇標準曲線符合線性回歸,檢測的峰型較好,可以與其他雜質的峰很好的分離出來,出峰的時間較為固定。體外釋放實驗以及藥代動力學實驗證明了納米載體的緩釋效應。體內(nèi)組織學分布情況證明無論葉酸修飾與否,載藥納米載體體內(nèi)紫杉醇藥物含量均在6h時含量最高,而純紫杉醇組紫杉醇峰時間在2h,由此結果可以得出,納米載體在體內(nèi)具有藥物緩釋作用。體內(nèi)細胞毒性實驗,腫瘤的藥物組織學分布實驗以及體內(nèi)的抗腫瘤療效實驗均證明了葉酸的腫瘤主動靶向性特點。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R737.31

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