發(fā)布時間：2018-01-25 08:45

  本文關鍵詞： 人正常子宮內膜上皮細胞 硫化氫 前列腺素 E2合成酶 siRNA　出處：《第二軍醫(yī)大學》2014年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：臨床上將在圍著床期時發(fā)生的早期妊娠丟失稱為生化妊娠，這種現象在人類中相對普遍。盡管體外輔助生殖技術得到迅速發(fā)展，許多潛在不孕原因得到克服，但其受孕率仍較低，其主要原因是胚胎植入失敗。而子宮內膜容受性是影響胚胎植入的關鍵因素之一，子宮內膜容受過程實際就是一個促炎性反應及子宮內膜血管的通透性增加的過程。在這過程中受到雌孕激素以及各種生長因子、細胞因子、粘附分子等組成一個精細的網絡系統(tǒng)共同調控，在這系統(tǒng)調控下子宮內膜才能達到對胚泡最大容受性，目前已有研究證實前列腺素是提高子宮內膜血管通透性的重要介質，并有研究發(fā)現如體內缺乏一些前列腺素合成酶可導致著床及子宮內膜蛻膜化失敗。另外有文獻報道在一些炎性疾病中細胞所產生的內源性H2S可上調環(huán)氧化酶-2（COX2）的表達。而H2S作為一種新型信號氣體分子，研究者發(fā)現其可參與體內許多系統(tǒng)的生理、病理機制,比如：H2S可通過激活血管平滑肌細胞鉀離子通道（KATP）使細胞內膜超極化，達到擴張血管平滑肌作用，從而控制血壓。而在生殖系統(tǒng)方面，2009年Patel等人首次在大鼠和人類的子宮肌、胎盤、胎膜中發(fā)現有胱硫醚 β 合酶（CBS）和胱硫醚 γ 裂解酶（CSE）的表達，可產生內源性H2S，隨后研究發(fā)現H2S在妊娠期間維持子宮靜止狀態(tài)起到一定作用。但目前人子宮內膜是否同樣有CBS和CSE的表達，且具有產生內源性H2S的能力，參與其生理、病理機制的調節(jié)，這方面尚無報道。為此，本課題以原代培養(yǎng)的人正常子宮內膜上皮細胞為研究對象，首先確認原代培養(yǎng)的人正常子宮內膜上皮細胞中含有CBS、CSE的表達，提示人正常子宮內膜上皮細胞可能具有產生內源性H2S的能力。隨后加入外源性的雌孕激素對細胞處理，明確人正常子宮內膜上皮細胞中CBS、CSE的表達受性激素調節(jié)。另外，通過對原代培養(yǎng)的人正常子宮內膜上皮細胞中加入H2S供體-NaHS、前體L-cys，明確了H2S對COX2、mPGES-1表達有調節(jié)作用。并利用siRNA干擾技術，進一步明確在人正常子宮內膜上皮細胞中內源性H2S生成的關鍵酶。 主要實驗結果如下： 1、原代培養(yǎng)人正常子宮內膜上皮細胞中CBS和CSE的表達情況 為說明原代培養(yǎng)的人正常子宮內膜上皮細胞是否有內源性H2S的能力，我們首先利用免疫組化方法證實在人正常子宮內膜中含有CBS、CSE的表達，而后進一步培養(yǎng)原代人正常子宮內膜上皮細胞，利用Western blot方法顯示細胞中同樣有CBS、CSE的表達，進一步證實了人正常子宮內膜上皮細胞可能具有產生內源性H2S的能力；同時為了解人正常子宮內膜上皮細胞中內源性H2S的產生是否受性激素影響，我們加入外源性雌二醇及孕激素，通過Western blot方法檢測CBS和CSE的表達，提示在雌二醇及孕激素均上調細胞中CBS和CSE的蛋白表達，且雌孕激素聯(lián)合給藥時更為顯著。根據以上結果作出以下推論：在人正常子宮內膜上皮細胞中可能有內源性H2S產生，且可能在分泌期時較高。 2、H2S調節(jié)原代人正常子宮內膜上皮細胞前列腺素E2合成酶的表達 為明確H2S如何調控原代培養(yǎng)的人正常子宮內膜上皮細胞中COX2、mPGES-1的表達。 首先，加入不同濃度的H2S的供體NaHS和前體L-半胱氨酸，然后通過Western blot方法檢測前列腺素E2合成酶-COX2和mPGES-1的蛋白表達情況，結果提示：H2S對原代培養(yǎng)的人正常子宮內膜上皮細胞中前列腺素E2合成酶-COX2和mPGES-1的蛋白表達起上調作用，且在一定范圍內呈劑量依耐性；接下來，為進一步確定CBS、CSE在L-cys在調節(jié)細胞中COX2、mPGES-1表達的作用，我們在原代培養(yǎng)的人正常子宮內膜上皮細胞中加入CBS siRNA和CSE siRNA轉染細胞，轉染24小時后，加入L-cys，Western blot方法檢測前列腺素E2合成酶-COX2和mPGES-1的蛋白表達情況，發(fā)現人正常子宮內膜上皮細胞中COX2、mPGES-1的蛋白表達均下降。通過以上實驗結果推論：H2S在人正常子宮內膜上皮細胞中通過上調前列腺素E2合成酶-COX2和mPGES-1的蛋白表達來實現對PGE2生成的上調作用。另外，為證實H2S在人正常子宮內膜上皮細胞中通過KATP通道來調節(jié)COX2、mPGES-1的表達，我們加入KATP拮抗劑-格列本脲，，實驗結果提示：格列本脲可逆轉H2S對細胞中COX2、mPGES-1表達的上調。 結論： 人正常子宮內膜上皮細胞受CBS和CSE共同作用下產生內源性H2S，且可能受體內雌二醇及孕激素調控產生變化。H2S可通過原代人正常子宮內膜上皮細胞KATP通道來上調COX2、mPGES-1的表達，從而增加人子宮內膜上皮細胞局部的PGE2濃度，進而參與到子宮內膜容受性和基質蛻膜化調節(jié)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R714.8

【共引文獻】

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1 楊玲玲;邵琿;原鵬波;郭曉s

本文編號：1462489