本文關鍵詞：腺病毒介導Foxo3a基因?qū)樸K所致的大鼠卵巢顆粒細胞及竇前卵泡損傷的研究

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【摘要】：研究背景卵巢早衰(Premature Ovarian Failure, POF)是指女性在40歲以前發(fā)生的以閉經(jīng)、不育、雌激素缺乏及促性腺激素水平升高為特征的一種疾病。目前已知的病因有遺傳因素、自身免疫性疾病、醫(yī)源性損傷如化療、放療或手術所致的卵巢血供不良,或特發(fā)性原因引起。其中,化療性卵巢早衰(Chemotherapy-induced Premature Ovarian Failure, CIPOF)是導致POF的一個重要因素。眾所周知,化療藥物通過誘導細胞凋亡等多種機制抑制癌細胞增殖,從而改善腫瘤患者預后、延長生存期。但不可置否,化療藥物的細胞毒性尤其是生殖毒性可對卵巢功能產(chǎn)生不良影響。研究表明,約有70-90%接受化療的女性腫瘤患者出現(xiàn)不同程度的卵巢功能受損。當化療藥物破壞僅成熟卵泡時引起的閉經(jīng)通常為可逆性,但當原始卵泡被破壞時則會導致持續(xù)閉經(jīng)或卵巢早衰,卵巢功能大多不能恢復。隨著女性罹患卵巢惡性腫瘤年輕化的趨勢,卵巢功能提前衰退不僅降低了患者的生育能力,同時導致圍絕經(jīng)期綜合征提前發(fā)生、生活質(zhì)量下降,進而引起一系列心理及社會問題。目前針對化療性卵巢早衰的應對措施有藥物治療、冷凍保存胚胎、冷凍卵母細胞、冷凍卵巢組織、卵巢組織移植、干細胞治療等。其中GnRH類似物主要通過抑制性腺軸從而降低卵巢細胞對化療藥物的敏感性,但因其具有“起爆效應”,即在早期應用時可刺激促性腺激素短暫升高,使卵巢細胞對化療藥物更為敏感,故應在化療前1-2周使用較好,但這又違背了腫瘤“早發(fā)現(xiàn)早治療”的原則；同時對于罹患激素依賴性惡性腫瘤患者及化療劑量較高的患者在使用GnRH的安全性及有效性還存在爭議。卵巢組織冷凍、卵巢組織移植即干細胞治療等技術雖具有一定的發(fā)展前景,但由于此類技術尚處于實驗階段,其臨床療效、生物倫理及安全性仍需進一步研究。因此,降低卵巢細胞對化療藥物敏感性從而降低化療藥物的細胞毒作用的同時,又不影響化療藥物對腫瘤細胞的殺傷作用,是解決化療性卵巢衰竭的關鍵。女性卵巢功能衰退的主要原因是卵泡數(shù)量和質(zhì)量的下降,其中卵巢始基卵泡的庫存大小和閉鎖程度直接影響雌性哺乳動物的生殖年齡。顆粒細胞作為卵泡內(nèi)的主要細胞成分,其生長分化是始基卵泡生長啟動以及卵泡發(fā)育的關鍵。研究表明靜止于Go/Gl期的顆粒細胞及卵泡對化療藥物不敏感,故研究參與調(diào)節(jié)這一過程的基因?qū)μ骄柯殉补δ艿谋Ｗo具有重要意義。業(yè)已證實,化療藥物對卵巢損傷的程度與藥物種類、用藥劑量等有關：在化療早期,藥物通過對細胞的直接殺傷作用誘導卵母細胞、顆粒細胞及其他支持細胞凋亡,同時可過度激活靜止卵泡使原始卵泡過度耗竭；在化療后期,卵巢由于局部血供障礙、微環(huán)境紊亂導致卵泡成熟受阻,卵巢功能衰退。順鉑是一種常見的化療藥物,研究顯示其可通過PTEN/AKT通路使原始卵泡過度活化,從而增加卵泡對化療藥物的敏感性,加速早期卵母細胞凋亡,導致大鼠卵巢儲備功能下降,進一步導致POF。我們前期研究已表明順鉑對體外培養(yǎng)的卵巢顆粒細胞及大鼠竇前卵泡均具有明顯毒性作用。因此如何避免顆粒細胞的過度凋亡及卵泡的提前耗竭是預防化療藥物所致卵巢功能損傷的重要研究方向。Foxo3a作為叉頭轉(zhuǎn)錄因子FOXO亞家族成員之一,對生物的發(fā)育、增殖、衰老和腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有調(diào)控作用。研究顯示[16,21]Foxo3a既可通過調(diào)控Fas/FasL、Bim、Caspases等凋亡相關蛋白表達誘導細胞凋亡,又可通過調(diào)控細胞周期蛋白如p27、CyclinD等使細胞周期停滯在Go/G1期。目前關于Foxo3a基因的研究主要用于腫瘤領域,研究顯示該基因表達低下或缺失可引起腫瘤細胞增殖能力增強,導致預后不良。但近年來多項研究顯示Foxo3a基因可能在哺乳動物卵泡發(fā)育中起到關鍵作用,然而關于其對哺乳動物生殖細胞和卵泡發(fā)育調(diào)控及卵巢功能的保護作用卻眾說紛紜。部分學者認為Foxo3a基因?qū)β殉补δ芷鸨Ｗo作用,如Castrillon、Schneider和Pelosi等人發(fā)現(xiàn)Foxo3a-/-小鼠出現(xiàn)原始卵泡過度耗竭、卵母細胞閉鎖和卵泡發(fā)育停滯,表現(xiàn)為生育能力減退而；轉(zhuǎn)基因Foxo3a大鼠的卵巢儲備功能則明顯優(yōu)于野生型大鼠；孟春花等發(fā)現(xiàn)Foxo3a基因可抑制豬卵巢顆粒細胞凋亡。然而另有部分學者呈反對意見：如Liu.H[16]等發(fā)現(xiàn)過表達Foxo3a基因可通過降低BMP-15和Smad蛋白從而抑制小鼠顆粒細胞增殖；隋旭霞等通過體外實驗推測Foxo3a及其下游靶基因Bim、FasL、Bax、p27kip1可促進新生大鼠卵母細胞凋亡；Liu.L[15]等通過建立轉(zhuǎn)基因小鼠模型證明卵母細胞內(nèi)Foxo3a基因持續(xù)表達引起卵母細胞及卵泡發(fā)育遲緩。哺乳動物的卵泡中存在多種細胞死亡配體-受體系統(tǒng)調(diào)控卵巢顆粒細胞的凋亡和卵泡的生長閉鎖,其過程非常復雜。研究顯示,哺乳動物卵泡發(fā)育早期由卵母細胞凋亡啟動原始卵泡及初級卵泡閉鎖,繼而引起顆粒細胞凋亡,而成熟卵泡的閉鎖則由顆粒細胞凋亡啟動,說明不同時期卵泡閉鎖的調(diào)控機制可能有所差異。有研究者發(fā)現(xiàn)某些蛋白如Smad3在卵巢功能調(diào)控中表現(xiàn)出階段特異性；與此同時,翟立軍等研究團隊發(fā)現(xiàn)部分調(diào)控個體發(fā)育的基因如miRNA在小鼠不同發(fā)育階段的卵泡及卵泡內(nèi)顆粒細胞的表達規(guī)律不一致,表明同種信號分子在不同階段卵泡中的顆粒細胞和體內(nèi)外顆粒細胞的表達可能存在差異。綜上所述,是否能夠通過調(diào)控Foxo3a基因的表達來誘導卵巢顆粒細胞的細胞周期停滯以及促進使竇前卵泡處于相對靜止期,從而降低卵巢顆粒細胞及竇前卵泡對化療藥物的敏感性,達到保護卵巢功能、預防化療性卵巢早衰是本實驗的主要研究目的。本實驗將利用重組腺病毒介導Foxo3a基因體外感染大鼠原代卵巢顆粒細胞和竇前卵泡,觀察該基因?qū)β殉差w粒細胞和竇前卵泡生長發(fā)育的影響和可能的調(diào)控機制,并探究其是否可以降低順鉑導致的卵巢毒性作用,進而探究Foxo3a基因防護順鉑損傷卵巢功能的可行性和有效性,為防治卵巢早衰尋找一種新的方法。目的1.克隆大鼠Foxo3a基因并構建大鼠Foxo3a基因腺病毒過表達載體,包裝純化重組腺病毒；體外培養(yǎng)原代大鼠卵巢顆粒細胞,觀察不同滴度重組腺病毒體外感染大鼠顆粒細胞的表達情況及表達效率。2.探討過表達Foxo3a基因?qū)Υ笫舐殉差w粒細胞體外發(fā)育的影響及調(diào)控機制,觀察該基因?qū)熕幬镯樸K誘導的卵巢顆粒細胞凋亡是否具有保護作用。3.建立體外分離培養(yǎng)大鼠竇前卵泡系統(tǒng),觀察順鉑對其的毒性作用,并探討重組腺病毒體外轉(zhuǎn)染大鼠竇前卵泡的可行性及過表達Foxo3a基因?qū)Υ笫蟾]前卵泡體外發(fā)育的影響。方法1.重組腺病毒構建：在Genebank中查詢大鼠Foxo3a基因序列,合成大鼠Foxo3a cDNA序列,克隆至pUC57載體中；選取經(jīng)酶切電泳分析及DNA測序鑒定正確的大鼠Foxo3a基因,經(jīng)過質(zhì)粒提取、酶切連接反應連接到腺病毒載體質(zhì)粒pDC315中,構建重組腺病毒載體pDC315-rFoxo3a;通過酶切電泳分析和測序進一步驗證目的基因的正確性后,將攜帶目的基因的重組質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人胚胎腎上皮細胞系293T細胞,包裝出重組腺病毒AD-rFoxo3a,進行測序驗證和滴度測定(TCID50法)。2.體外分離培養(yǎng)大鼠原代卵巢顆粒細胞,利用HE染色及FSHR免疫熒光法進行原代顆粒細胞鑒定,確定重組腺病毒體外感染大鼠卵巢原代顆粒細胞最佳感染復數(shù)(MOI),通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)及蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)方法檢測目的基因Foxo3a的表達情況。3.實驗分為3組：實驗組(重組腺病毒AD-rFoxo3a)、陰性對照組(空載腺病毒rAD)及空白對照組。觀察各組細胞生長增殖情況并繪制細胞生長曲線；利用Western-blot法檢測各組細胞中cyclinD1、p27、pax、Bim蛋白表達；利用流式細胞術、Hoechst33342/PI染色法分別檢測各組細胞的細胞周期及細胞凋亡情況。各組轉(zhuǎn)染48h后加入最適濃度的順鉑,觀察各組細胞生長狀況,利用流式細胞術檢測細胞凋亡情況。4.體外分離培養(yǎng)大鼠竇前卵泡(直徑120-150μm),實驗分組同前(30個卵泡/組)。利用不同滴度的重組腺病毒體外轉(zhuǎn)染卵泡,觀察卵泡生長發(fā)育形態(tài)及綠色熒光蛋白EGFP和目的蛋白Foxo3a的表達情況；各組轉(zhuǎn)染一定時間后加入最適濃度的順鉑,觀察各組卵泡形態(tài)學變化及閉鎖情況。結果1.本實驗構建的攜帶大鼠Foxo3a基因的質(zhì)粒經(jīng)酶切電泳可見約2000bp DNA條帶,與Genebank中大鼠Foxo3a基因片段長度(2019bp)一致,經(jīng)測序鑒定后行同源性分析為99%。重組腺病毒質(zhì)粒pDC315-rFoxo3a經(jīng)酶切鑒定及測序證實重組質(zhì)粒構建成功。重組腺病毒質(zhì)粒以及骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞15d可見病毒空斑,培養(yǎng)21d收毒,經(jīng)病毒擴增后行瓊脂糖電泳鑒定及DNA測序證明重組腺病毒AD-rFoxo3a構建成功,測定滴度為1.106×1010PFU/mL。2.分離培養(yǎng)的大鼠原代卵巢顆粒細胞經(jīng)鑒定表明細胞純度及存活率均90%。當MOI為50時,重組腺病毒對顆粒細胞的感染效率最高,且對細胞無明顯毒性。RT-PCR法檢測結果發(fā)現(xiàn)實驗組Foxo3a mRNA表達量明顯高于對照組,且在轉(zhuǎn)染后36h表達水平最高；Western-blot法檢測結果發(fā)現(xiàn)實驗組有分子量約80KD蛋白的表達,而對照組中無表達。3.(1)通過繪制生長曲線結果發(fā)現(xiàn),實驗組卵巢顆粒細胞生長較對照組受到抑制,而空白對照組及陰性對照組顆粒細胞生長良好,呈現(xiàn)S型生長曲線,兩組細胞增值率無明顯差異；(2)流式細胞儀檢測細胞周期結果顯示：實驗組細胞在G1期的比例較對照組明顯增加,S期細胞所占比例明顯減少(P均0.01)；(3)流式細胞儀檢測細胞凋亡及Hoechst33342/PI染色結果發(fā)現(xiàn)：實驗組細胞凋亡率較對照組增加(P0.01),而空白對照組及陰性對照組之間細胞凋亡率無明顯差異。(4) Western-blot檢測相關蛋白結果發(fā)現(xiàn)：實驗組Bim、p27、CyclinD1蛋白較對照組明顯高表達,空白對照組和陰性對照組之間各個蛋白表達無差異；同時,各組均為發(fā)現(xiàn)明顯Bax蛋白表達；(5)各組細胞加入順鉑24h后行流式細胞儀檢測結果發(fā)現(xiàn),實驗組卵巢顆粒細胞凋亡率高于空白對照組及實驗對照組(P0.01),后兩組細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義。4.機械法聯(lián)合酶消化法分離的大鼠竇前卵泡體外培養(yǎng)24h可貼壁,平均培養(yǎng)7d后出現(xiàn)卵母細胞逸出、基底膜破裂等卵泡閉鎖表現(xiàn),在加入順鉑后卵泡閉鎖率明顯增加。用不同滴度的重組腺病毒體外轉(zhuǎn)染大鼠竇前卵泡結果顯示,卵泡內(nèi)部及基膜表面均未見明顯綠色熒光蛋白表達,RT-PCR法未檢測Foxo3a的表達。結論1.本實驗成功構建了大鼠重組慢病毒AD-rFoxo3a,具有滴度高、體外轉(zhuǎn)染細胞效率高的特點,并能成功感染體外培養(yǎng)的大鼠原代卵巢顆粒細胞,使目的基因Foxo3a在細胞中得以有效轉(zhuǎn)錄及表達,為進一步研究該基因的對卵巢顆粒細胞的調(diào)控作用及對化療藥物導致的卵巢功能衰退的防治奠定了基礎。2.過表達Foxo3a基因在體外可通過促進cyclinD1、p27蛋白表達促使大鼠卵巢顆粒細胞周期停滯在靜止期,并可通過促進Bim蛋白表達誘導卵巢顆粒細胞凋亡；同時,本實驗未發(fā)現(xiàn)過表達Foxo3a基因可以逆轉(zhuǎn)順鉑誘導卵巢顆粒細胞凋亡的作用。3.重組腺病毒對體外培養(yǎng)的大鼠竇前卵泡轉(zhuǎn)染效率極低下,可能因病毒無法通過卵泡表面的基底膜以及體外環(huán)境缺少相關因子刺激有關；同時本實驗未觀察到重組腺病毒AD-rFoxo3a與卵泡共培養(yǎng)對順鉑的卵泡毒性有保護作用。4.關于Foxo3a基因?qū)β雅莅l(fā)育和閉鎖的調(diào)控以及卵巢功能的影響還有賴于體內(nèi)實驗進一步明確。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R711.75

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