本文關鍵詞：構建和鑒定靶向穿膜的多功能分子探針iCREKA

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【摘要】：目的：一、合成環(huán)狀分子探針iCREKA,驗證該環(huán)肽的靶向性和穿膜能力,為進一步的探針制備和腫瘤靶向顯像奠定基礎。二、用異硫氰酸熒光素(fluorecein isothiocyante,FITC)標記環(huán)肽制備熒光探針(FITC-iCREKA),用熒光成像方法研究該熒光探針能否使腫瘤顯像,評價該探針能否發(fā)展成為腫瘤的靶向熒光分子探針。三、用正電子核素18F標記環(huán)肽iCREKA制備PET分子探針(18F-iCREKA),通過用：microPET/CT顯像,探索并評價該探針用于腫瘤PET/CT顯像的可行性。方法：一、環(huán)狀分子探針iCREKA的合成及靶向性和穿膜作用的驗證1.環(huán)狀分子探針iCREKA的化學合成先采用固相9-芴甲氧羰基(Fmoc)肽化學合成方法合成線性多肽CREKAPLGLAGRKKRRQRRRC。以2—氯三苯基氯樹脂為載體,配合Fmoc氨基保護策略,按照氨基酸序列從羧基端(C端)至氨基端(N端)按順序添加氨基酸,首先將C端第一個氨基酸即Cys的羧基以共價鍵的形式與樹脂相連,再以Cys的氨基為合成起點,使其與Arg的羧基發(fā)生�；磻�,形成肽鍵。反應結束后用適量的吡啶和乙酸酐封閉樹脂上剩余的活性位點。后續(xù)氨基酸以HOBt/HBTU/DIEA為縮合劑依次連接,直至合成整條線性多肽。然后將首尾兩個Cys進行環(huán)化處理,環(huán)化后再將一個賴氨酸,連在C末端。為增加iCREKA的穩(wěn)定性,對其進行N端乙�；揎�。反應結束后,以三氟乙酸為主切割劑將目的肽段從樹脂上裂解下來,合成產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜分離、純化、分析,質(zhì)譜分析鑒定。2.異硫氰酸熒光素(FITC)標記iCREKA將異硫氰酸熒光素(FITC)與環(huán)肽iCREKA的末端賴氨酸相反應而制備熒光標記多肽探針FITC-iCREKA.在采用固相9-芴甲氧羰基(Fmoc)肽化學合成方法合成環(huán)肽iCREKA后,將FITC連于末位賴氨酸的氨基。即用碳酸氫鈉緩沖液pH9.8稀釋Fmoc-Lys-OH為5mg/ml放入透析袋,將透析袋放入100ml含0.1 mg/ml FITC的pH9.8碳酸氫鈉緩沖液(新配制)的燒杯中,用鋁鉑包燒杯以避光,4℃攪拌過夜；上述溶液對PBS在4℃透析以終止反應,其間至少更換PBS液三次,直致480nm的吸收為零；加入0.5g/L的疊氮鈉。反應結束后,以三氟乙酸為主切割劑將目的肽段從樹脂上裂解下來,合成產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜分離、純度,質(zhì)譜分析鑒定。3.對照肽FITC-CREKA的合成先按固相肽合成方法合成對照肽CREKA,再將FITC標記在賴氨酸的側(cè)鏈氨基上。4.MMP-2對FITC-iCREKA細胞穿膜能力的作用的驗證(1)加入金屬蛋白酶2(MMP-2)后與腦膠質(zhì)瘤U87細胞結合實驗：a.細胞準備：選用裸鼠腦膠質(zhì)瘤細胞株U87。膠質(zhì)瘤U87腫瘤細胞株在5%CO2,37℃,含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)至細胞處于對數(shù)生長期時,用2ml含0.25%EDTA的胰酶消化2分鐘,含血清培養(yǎng)基中和胰酶,傳代至35mm培養(yǎng)皿,待細胞貼壁時備用。b.MMP-2活化：取80μL 0.7mg/ml鼠源性MMP2/Tris.HCl溶液,加入0.1ml2.5mmol/L4-APMA,37℃水浴箱中孵育2hr。c.熒光檢測：取100 μl0.7mg/ml活性MMP-2/1640溶液,加入0.9ml新鮮配置無血清細胞培養(yǎng)基熒光素探針FITC-iCREKA 10mg/ml溶液,過濾除菌,分別加入1ml至上述細胞培養(yǎng)皿,37℃孵育60min后,PBS沖洗培養(yǎng)皿(5min×3次),75%酒精固定,DAPI染色后,置于熒光顯微鏡下觀察活細胞內(nèi)熒光的分布情況。胰酶消化,用流式細胞儀檢測細胞內(nèi)熒光攝取強度。(2)未加入MMP-2時與腦膠質(zhì)瘤U87細胞結合實驗：a.細胞準備：選用裸鼠腦膠質(zhì)瘤細胞株U87。膠質(zhì)瘤U87腫瘤細胞株在5%CO2,37℃,含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)至細胞處于對數(shù)生長期時,用2ml含0.25%EDTA的胰酶消化2分鐘,含血清培養(yǎng)基中和胰酶,傳代至35mm培養(yǎng)皿,待細胞貼壁時備用。b.熒光檢測：加入與上述實驗相同量的熒光素探針FITC-iCREKA,過濾除菌,分別加入1ml至上述細胞培養(yǎng)皿,37℃孵育60min后,PBS沖洗培養(yǎng)皿(5min×3次)后,置于熒光顯微鏡下觀察活細胞內(nèi)熒光的分布情況。胰酶消化,用流式細胞儀檢測細胞內(nèi)熒光攝取強度。(3)對照肽FITC-CREKA與腦膠質(zhì)瘤U87細胞結合實驗按照與實驗4相同的方法,將U87細胞與對照肽FITC-CREKA進行細胞結合實驗,用熒光顯微鏡觀察加入MMP-2和未加入MMP-2細胞內(nèi)熒光的分布情況。胰酶消化,用流式細胞儀檢測細胞內(nèi)熒光攝取強度。5.荷腦膠質(zhì)瘤U87裸鼠腫瘤模型的建立和確認(1)荷腦膠質(zhì)瘤U87裸鼠腫瘤模型的建立采用裸鼠腦膠質(zhì)瘤U87細胞株。取對數(shù)生長期的腫瘤細胞,用含0.25%EDTA的胰蛋白酶消化3分鐘后,1000rpm離心5min,棄上清,加入無菌的PBS,輕輕吹打使之成為單細胞懸液,取一滴細胞懸液滴在細胞計數(shù)板上計數(shù),并用PBS將濃度調(diào)整為1×106個細胞/0.2ml的細胞懸液。取4-6周齡的雌性裸鼠,用75%的酒精棉球在裸鼠右側(cè)腋窩消毒,用胰島素注射器在消毒部位皮下注射上述細胞懸液,注射劑量為0.2ml/只。SPF條件下飼養(yǎng),當瘤體直徑長至1cm,將裸鼠麻醉,剖出腫瘤組織,小心去除腫瘤包膜,將腫瘤組織切成小塊,用接種針將組織接種到右側(cè)腋窩皮下。共接種40只裸鼠,觀察成瘤情況。待腫瘤直徑達5-10mm時,用于實驗研究。(2)組織病理學檢查將成瘤的裸鼠處死,分離取出腫瘤組織,做石蠟切片,進行HE染色,然后用正置顯微鏡觀察是否為腦膠質(zhì)瘤。6.FITC-iCREKA在腫瘤模型體內(nèi)靶向性的驗證取荷腦膠質(zhì)瘤裸鼠的尾靜脈注射FITC-iCREKA (1mM,150 ul),于注射后1小時處死動物,分離腫瘤組織,迅速做冰凍切片。用兔源性抗纖維蛋白原抗體做一抗,Cy3標記山羊抗兔IgG為二抗,做免疫熒光。置于熒光顯微鏡下觀察纖維蛋白原及FITC-iCREKA在腫瘤組織內(nèi)的分布情況。7.腫瘤組織內(nèi)金屬蛋白酶-2(MMP-2)免疫熒光成像取荷腦膠質(zhì)瘤裸鼠的尾靜脈注射FITC-iCREKA (1mM,150 μl),于注射后1小時處死動物,分離腫瘤組織,迅速做冰凍切片。然后用鼠源性抗MMP-2抗體做一抗,Cy3標記山羊抗小鼠IgG為二抗,做免疫熒光。并用DAPI進行細胞核染色。然后置于熒光顯微鏡下觀察MMP-2及FITC-iCREKA在腫瘤組織內(nèi)的分布情況。8.FITC-iCREKA在腫瘤組織內(nèi)的攝取及分布研究經(jīng)荷膠質(zhì)瘤裸鼠的尾靜脈注射FITC-iCREKA (1mM,150 μl),分別于1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時后處死動物,分離腫瘤組織,做冰凍切片,用DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)染色后,置于熒光顯微鏡下觀察各時間點FITC-iCREKA在腫瘤組織內(nèi)的分布情況。對照組：經(jīng)荷瘤鼠尾靜脈注射對照肽FITC-CREKA (1mM,150 μl),在相同時間點處死動物,分離腫瘤組織,做冰凍切片、DAPI染色后,熒光顯微鏡下觀察腫瘤組織內(nèi)的熒光分布情況。二、腫瘤模型FITC-iCREKA熒光成像研究1. FITC-iCREKA在荷膠質(zhì)瘤腫瘤模型體內(nèi)的熒光生物學分布研究(1) FITC-iCREKA腫瘤熒光成像取荷膠質(zhì)瘤U87細胞株的裸鼠,經(jīng)尾靜脈注射FITC-iCREKA (1mM,150μl),1小時后脫頸處死動物,分離取出腫瘤及腦、心臟、肝臟、脾臟、雙肺、雙腎、腸道等組織,用生理鹽水充分沖洗各組織、臟器表面以去除污染,然后依次擺放于干凈的培養(yǎng)皿中,置于熒光成像儀內(nèi)成像,觀察腫瘤及各臟器、組織的熒光分布,并通過勾畫ROI測量熒光攝取量,比較腫瘤與正常組織對FITC-iCREKA的攝取差異。(2)對照肽FITC-CREKA荷瘤裸鼠腫瘤及腦組織成像取荷膠質(zhì)瘤U87細胞株的裸鼠,經(jīng)尾靜脈注射FITC-CREKA (1mM,150μl),1小時后脫頸處死動物,分離取出腫瘤及腦、心臟、肝臟、脾臟、雙肺、雙腎、腸道等組織,用生理鹽水充分沖洗各組織、臟器表面以去除污染,然后依次擺放于干凈的培養(yǎng)皿中,置于熒光成像儀內(nèi)成像,觀察腫瘤及各臟器、組織的熒光分布,并通過勾畫ROI測量熒光攝取量,比較腫瘤與正常組織對FITC-CREKA的攝取差異。2.荷膠質(zhì)瘤腫瘤模型冠狀斷層成像取荷膠質(zhì)瘤U87裸鼠,經(jīng)尾靜脈注射FITC-iCREKA (1mM,150μl),暗室放置1小時后脫頸處死,置于-80冰箱過夜,次日將動物進行冠狀位切層,暴露腫瘤組織后將動物置于潔凈的培養(yǎng)皿,用熒光成像儀進行成像觀察各個組織、臟器及腫瘤內(nèi)熒光分布情況。3.熒光成像分析用熒光顯像儀Kodak In-Vivo Imaging System F配置的Kodak MI分析軟件進行圖像分析。在熒光圖像上沿腫瘤和各組織的邊緣勾畫感興趣區(qū)(Region of interest, ROI),測量各感興趣區(qū)內(nèi)的熒光計數(shù),計算腫瘤與正常組織的腫瘤/非腫瘤比值Otumor/non-tumor, T/NT ratios)。三、PET分子探針18F-iCREKA的合成和PET/CT顯像研究1.合成18F-iCREKA以2-溴丙酸乙酯為前體,經(jīng)過18F親核取代、氫氧化鉀水解,再與二對硝基苯碳酸酯(NPC)反應得到活化的18F-NFP,多肽與18F-NFP在無水二甲基亞砜(DMSO)溶劑中,以二異丙基乙基胺(DIPEA)為堿,40℃下反應5min,多步驟反應合成18F-FP-iCREKA。用0.22μm微孔濾膜去除細菌。然后用HPLC和放射性薄層層析法(TLC)測定其化學純度和放化純度�？偡磻獣r間為180分鐘,放化純度為97%。2. micro PET/CT 顯像：取荷膠質(zhì)瘤U87裸鼠,經(jīng)尾靜脈注射18F-iCREKA顯像劑5.50-7.40MBq(150～200μCi),用異氟醚麻醉后分別于30分鐘、60分鐘及120分鐘行microPET/CT顯像(圖像采集時間為10分鐘),觀察腫瘤及各組織對18F-iCREKA的攝取情況。所用儀器為Inveon microPET/CT掃描儀(SIEMENS, Germany)。圖像均采用3維的有序子集最大期望值法(ordered subsets expectation maximum, OSEM)進行圖像重建并用CT進行衰減校正。3. microPET/CT圖像分析采用microPET/CT配置的Syngo分析軟件,在PET圖像上沿腫瘤和各組織的邊緣勾畫感興趣區(qū),測量各感興趣區(qū)內(nèi)的放射性計數(shù),計算腫瘤與正常組織的腫瘤/非腫瘤比值。四、統(tǒng)計學分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示,加入MMP-2和未加入MMP-2時熒光強度比較采用兩獨立樣本t檢驗；加入MMP-2后FITC-iCREKA與對照肽熒光強度比較采用兩獨立樣本t經(jīng)驗；FITC-iCREKA與對照肽腫瘤/非腫瘤比值比較采用兩獨立樣本t檢驗；P0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。結果：一、環(huán)狀分子探針iCREKA的合成及靶向性和穿膜作用的驗證1.環(huán)狀分子探針iCREKA的化學合成固相合成的環(huán)狀分子探針iCREKA呈現(xiàn)為白色粉末。經(jīng)質(zhì)譜分析鑒定,主峰分子量(m/z：Da)為2668.8,與iCREKA的理論分子量2665.26相符,證明合成正確。經(jīng)HPLC純化、分析結果顯示iCREKA的純度為98.27%。2.異硫氰酸熒光素(FITC)標記iCREKAFITC-iCREKA合成后產(chǎn)物為粉黃色粉末。質(zhì)譜分析鑒定,FITC-iCREKA的主峰分子量(m/z,Da)為3170,與FITC-iCREKA的理論分子量3167.81相符,證明標記成功。經(jīng)HPLC純化、分析結果顯示FITC-iCREKA純度為98.23%。3.對照肽FITC-CREKA的合成FITC-CREKA合成后產(chǎn)物為粉黃色粉末。質(zhì)譜分析鑒定,FITC-CREKA的主峰分子量(m/z,Da)為993,6,與FITC-CREKA的理論分子量995.09相符,證明標記成功。經(jīng)HPLC純化、分析結果顯示FITC-iCREKA純度為98.66%。4.MMP-2對FITC-iCREKA細胞穿膜能力的作用的驗證(1)加入金屬蛋白酶2(MMP-2)后與腦膠質(zhì)瘤U87細胞結合實驗：經(jīng)酒精固定和DAPI染色后,置于倒置顯微鏡下,首先用藍光激發(fā)可見U87細胞膜及細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)高強度的綠色熒光；用藍紫色光激發(fā)可見深藍色細胞核顯像：綠色熒光出現(xiàn)的位置與細胞核位置吻合。說明FITC-iCREKA能被MMP-2切開,并通過細胞膜進入細胞內(nèi)。共聚焦顯微鏡下觀察熒光在細胞內(nèi)的分布,結果顯示,細胞膜、細胞漿、核膜及核仁內(nèi)均可見高強度的綠色熒光分布。說明加入MMP-2后,FITC-iCREKA不僅能夠穿過細胞膜進入細胞漿,還能穿過核膜進入核仁內(nèi)。(2)未加入MMP-2時與腦膠質(zhì)瘤U87細胞結合實驗：將與上述實驗相同量的熒光探針FITC-iCREKA與U87細胞在相同條件下孵育,經(jīng)固定及DAPI染色后,置于倒置顯微鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)U87細胞僅有輕微的綠色熒光攝取。說明未加入MMP-2時,FITC-iCREKA無法穿過細胞膜進入細胞內(nèi)。共聚焦顯微鏡觀察可見,細胞內(nèi)僅有極少量綠色熒光攝取。流式細胞儀檢測結果顯示,加入活化的MMP-2后的熒光強度明顯高于未加入時的熒光強度,差異具有統(tǒng)計學意義(14591.33±3099.18 vs.3328.50±910.05,t=4.774,P=0.017)。(3)對照肽FITC-CREKA與腦膠質(zhì)瘤U87細胞結合實驗：將對照肽FITC-CREKA與U87細胞進行細胞結合實驗,結果顯示,無論加入活化的MMP-2還是未加入MMP-2,細胞內(nèi)均僅見極少量綠色熒光分布,提示,FITC-CREKA無穿膜能力,不能進入細胞內(nèi)。同樣加入活化的MMP-2孵育后,實驗組(FITC-iCREKA)的細胞內(nèi)熒光強度明顯高于對照肽FITC-CREKA細胞內(nèi)的熒光強度,差異具有統(tǒng)計學意義(14591.33±3099.18vs.3259.67±654.45,t=-6.196,P=0.003)。5.腦膠質(zhì)瘤U87腫瘤模型的建立無胸腺裸鼠皮下接種U87細胞,SPF環(huán)境下飼養(yǎng)15天左右可見局部皮膚小凸起,經(jīng)2-3周腫瘤生長至5mm～10mm用于實驗。共接種40只,其中32只成瘤,8只無腫瘤生長,成瘤率為80%。將其中1只模型的腫瘤組織做HE染色,進行病理組織學檢測,結果顯示符合高級別腦膠質(zhì)瘤改變。6.FITC-iCREKA在腫瘤模型體內(nèi)靶向性的驗證為驗證FITC-iCREKA對腫瘤間質(zhì)內(nèi)纖維蛋白的靶向性,將荷瘤鼠尾靜脈注射FITC-iCREKA后1小時分離腫瘤組織,進行纖維蛋白原免疫熒光實驗,觀察腫瘤組織內(nèi)纖維蛋白原的分布。熒光顯微鏡下可見,腫瘤組織內(nèi)分布大量紅色熒光,呈條索狀；同時可見大量綠色熒光,且二者的分布及位置一致。說明腫瘤組織內(nèi)存在大量纖維蛋白原,且FITC-iCREKA能與腫瘤組織內(nèi)的纖維蛋白特異性結合。7.腫瘤組織內(nèi)金屬蛋白酶-2(MMP-2)免疫熒光成像為觀察腫瘤組織內(nèi)MMP-2的表達情況,將荷瘤鼠尾靜脈注射FITC-iCREKAl小時后分離腫瘤組織,做MMP-2的免疫熒光實驗。熒光顯微鏡下,腫瘤組織內(nèi)見大量紅色熒光,與細胞核位置相吻合。說明腫瘤組織內(nèi)明顯高表達MMP-2。8.FITC-iCREKA在腫瘤組織內(nèi)的攝取及分布研究經(jīng)荷瘤鼠尾靜脈注射FITC-iCREKA (1mM,150μl)后在不同時間點分離腫瘤組織,制作切片在熒光顯微鏡下觀察熒光標記多肽在腫瘤內(nèi)的分布情況,結果顯示在注射后1小時,FITC-iCREKA大量聚集于腫瘤間質(zhì)內(nèi),腫瘤細胞未見明顯熒光攝取。在注射后3小時,腫瘤細胞內(nèi)可見明顯熒光攝取。經(jīng)荷瘤鼠尾靜脈注射對照肽FITC-CREKA后在相同時間點分離腫瘤組織,制作切片在熒光顯微鏡下觀察,結果顯示,熒光一直聚集于腫瘤間質(zhì),腫瘤細胞內(nèi)始終未見熒光攝取。靜脈注射FITC-iCREKA后分離荷瘤鼠腦組織行切片熒光顯像,結果發(fā)現(xiàn)正常腦組織僅有少量熒光攝取,明顯低于腫瘤組織。二、膠質(zhì)瘤FITC-iCREKA熒光成像研究1. FITC-iCREKA熒光探針在荷瘤鼠體內(nèi)的生物學分布研究荷瘤鼠經(jīng)尾靜脈注射FITC-iCREKA后1小時熒光成像,結果顯示腫瘤可見明顯綠色熒光分布,明顯高于正常腦組織,為較為客觀評價FITC-iCREKA在體內(nèi)的分布情況,我們利用成像儀配制的圖像分析軟件沿臟器及組織邊緣勾畫感興趣區(qū),測定感興趣區(qū)內(nèi)的熒光攝取值,根據(jù)腫瘤/非腫瘤比值來評價探針在體內(nèi)的分布差異。本研究中,腫瘤/腦的比值為3.2±0.78,其他臟器中,雙腎及腸道可見明顯綠色熒光,腫瘤/腎、腫瘤/小腸比值低于2.0,但腫瘤與其他臟器的比值均2.0。FITC-iCREKA在荷瘤裸鼠的體內(nèi)分布與在正常裸鼠的體內(nèi)分布基本一致,均是經(jīng)肝膽和泌尿系統(tǒng)排泄,在荷瘤裸鼠體內(nèi)FITC-iCREKA在肝臟內(nèi)清除也較快,1小時成像時已基本排泄完。注射對照肽FITC-CREKA的荷瘤裸鼠分離腫瘤組織后,熒光成像結果顯示,腫瘤內(nèi)僅見少量熒光攝取,略高于腦組織,腫瘤/腦比值為1.63±0.68,明顯低于FITC-iCREKA的腫瘤/腦比值,兩者差異具有統(tǒng)計學意義(3.2±0.78 vs.1.63±0.68,-5.067,P=0.000)。2.荷瘤鼠整體熒光斷層成像取荷膠質(zhì)瘤U87裸鼠,經(jīng)尾靜脈注射FITC-iCREKA (1mM,150μl),暗室放置1小時后脫頸處死,置于-80冰箱過夜,次日將動物進行冠狀位切層,暴露腫瘤組織后用熒光成像設備成像。從整體情況看,熒光分布與分離臟器組織后成像的分布基本一致。首先可見腫瘤呈熒光明顯攝取,熒光強度明顯高于正常腦組織,其他臟器心臟、雙肺、肝臟、脾臟及肌肉組織內(nèi)熒光分布均很低,但腸道熒光攝取很高,此外皮膚也呈明顯熒光攝取。該整體斷層成像亦提示FITC-iCREKA能特異性靶向腫瘤病灶,但需排除皮膚自發(fā)光的影響。三、PET分子探針18F-iCREKA的研制和PET/CT顯像研究1)18F-iCREKA的放化標記首先制備輔助基團18F-NFP,2-溴丙酸乙酯經(jīng)過親核氟化、KOH水解和NPC活化三步“一鍋法”反應制得的18F-NFP,18F-NFP與多肽偶聯(lián)再經(jīng)過固相柱PlusC18分離純化,成功得到放化純度為97%的18F-iCREKA,總反應時間為180分鐘。18F-iCREKA液體澄清、透明,經(jīng)用0.22μm微孔過濾器除菌后用于動物顯像研究。2)荷瘤鼠microPET/CT顯像研究：取腫瘤直徑在5mm-10mm的荷膠質(zhì)瘤U87裸鼠,經(jīng)尾靜脈注射顯像劑18F-iCREKA 150μCi左右,分別在注射后30分鐘、60分鐘及120分鐘行microPET/CT顯像,結果顯示,首先,在顯像的各個時間點均未觀察到骨骼內(nèi)有放射性聚集,說明此顯像劑在體內(nèi)未出現(xiàn)脫氟情況,較穩(wěn)定。其次,從圖像上來看,注射顯像劑30分鐘顯像時,即可見腫瘤明顯顯像,但是更多的顯像劑聚集在腹腔肝臟和腸道內(nèi),膀胱內(nèi)的放射性也很高,全身肌肉等血本底較高,腦組織未見放射性分布。60分鐘顯像時,腫瘤內(nèi)放射性攝取較前升高,顯像較前清楚,周圍血本底放射性分布下降,肝臟、腸道和膀胱內(nèi)仍見大量放射性分布,腦組織內(nèi)仍未見放射性分布。120分鐘時顯像,腫瘤內(nèi)放射性攝取進一步升高,顯像更清楚,邊界清楚,肝臟放射性下降,但可見雙腎明顯顯影,腸道和膀胱的放射性仍然很高。從各時間點的microPET/CT圖像看,該探針在體內(nèi)的生物學分布與熒光成像時的分布大致相同,均提示是經(jīng)肝膽系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)排泄,這對腹盆腔臟器和腫瘤的顯示造成困難。結論1.本研究成功地合成了環(huán)狀分子探針iCREKA,純度為98.27%,可滿足實驗要求。2.成功地用FITC標記iCREKA而制備了熒光探針FITC-iCREKA,純度達98.23%,達到體內(nèi)及體外實驗要求。3.體外細胞攝取實驗證明iCREKA能被MMP2在特定位點切開,并能進入細胞被膠質(zhì)瘤U87細胞大量攝取。4.腫瘤組織熒光成像證明FITC-iCREKA能大量聚集于腫瘤組織內(nèi),主要被腫瘤細胞攝取。5.荷瘤鼠體內(nèi)熒光生物學分布研究及整體斷層顯像顯示FITC-iCREKA能特異性靶向膠質(zhì)瘤病灶并將病灶充分“染色”,腫瘤/腦比值高。6.荷瘤鼠體內(nèi)熒光生物學分布研究顯示FITC-iCREKA主要經(jīng)肝膽系統(tǒng)及泌尿系統(tǒng)排泄。7.成功制備了PET分子探針18F-iCREKA,放化純度達97.0%,達到體內(nèi)及體外實驗要求。8.荷瘤鼠microPET/CT和PET/CT顯像證實18F-iCREKA可以特異性靶向膠質(zhì)瘤病灶,在注射后30分鐘顯像即可見腫瘤顯像,并隨時間延長,腫瘤顯像更加清楚,而周圍血本底隨時間延長而下降,具有很好的腫瘤與非腫瘤比值。荷瘤鼠體內(nèi)18F-iCREKA放射性分布與FITC-iCREKA體內(nèi)熒光分布相一致。提示18F-iCREKA可做為靶向腫瘤的PET分子探針,在腫瘤的分子顯像中具有良好的應用潛能。
【關鍵詞】：iCREKA 膠質(zhì)瘤 分子影像 熒光成像 microPET/CT顯像
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R730.44
【目錄】：

• 摘要3-14
• ABSTRACT14-27
• 第一章 緒論27-46
• 1.1 前言27
• 1.2 分子影像學概述27-28
• 1.3 分子探針28-30
• 1.4 歸巢肽的研究進展30-31
• 1.5 腫瘤間質(zhì)纖維蛋白-纖連蛋白復合物31-32
• 1.6 細胞穿膜肽的研究進展32-34
• 1.7 基質(zhì)金屬蛋白酶34-38
• 1.8 分子影像技術38-39
• 1.9 PET/CT顯像39-44
• 1.10 本課題的研究路線44-46
• 第二章 環(huán)狀分子探針iCREKA的合成及靶向性和穿膜作用的驗證46-76
• 2.1 前言46
• 2.2 材料與方法46-57
• 2.3 結果57-71
• 2.4 討論71-75
• 本章小結75-76
• 第三章 腫瘤模型FITC-iCREKA熒光成像研究76-85
• 3.1 前言76
• 3.2 材料與方法76-79
• 3.3 結果79-82
• 3.4 討論82-84
• 本章小結84-85
• 第四章 PET分子探針~(18)F-iCREKA的研制和PET/CT顯像研究85-95
• 4.1 前言85-86
• 4.2 材料與方法86-88
• 4.3 結果88-91
• 4.4 討論91-94
• 本章小結94-95
• 參考文獻95-105
• 縮略詞中英文對照表105-107
• 攻讀學位期間取得的研究成果107-108
• 致謝108-109

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本文編號：813778