發(fā)布時間：2020-06-01 08:49

【摘要】： 目的: 超聲分子影像技術(shù)(Molecular ultrasound imaging)是對粘附在血管內(nèi)皮細胞上的特異分子進行靶向性超聲對比成像(Ultrasound contrast imaging)。該技術(shù)應用靶向性超聲微泡(Targeted microbubbles)作為示蹤劑,這種靶向性超聲微泡既具有與紅細胞相似的流變學特征,可順利的通過組織微循環(huán),又可與特異性靶向分子有效的結(jié)合,從而達到特異性地評價血循環(huán)內(nèi)皮細胞上分子學變化或?qū)崿F(xiàn)檢測血循環(huán)內(nèi)固定的靶分子的目的。臨床上有望用于評價血管內(nèi)皮炎癥、檢測血栓形成或早期發(fā)現(xiàn)腫瘤等領(lǐng)域。實現(xiàn)該技術(shù)的核心就是構(gòu)建有效、特異的靶向超聲微泡。 通過生物素-親和素(Avidin-biotin)橋接法構(gòu)建靶向超聲微泡是目前國外研究較多的方法,但國內(nèi)無相關(guān)研究。此外,靶向超聲微泡構(gòu)建完成后其靶向粘附效能及其特異性的檢測是評價靶向微泡構(gòu)建成功與否的重要步驟。在體實驗因體內(nèi)參與靶向微泡粘附的因素較多,難以準確評價靶向微泡與靶目標的粘附效能及其特異性。平行板流動腔(Parallel plate flow chamber)技術(shù)是體外研究細胞力學行為(特別是細胞粘附)的主要手段之一,用其進行白細胞對內(nèi)皮細胞粘附的研究幾乎可以代替體內(nèi)實驗,提示平行板流動腔法有望用于體外評價靶向微泡構(gòu)建效果。 本研究目的在于:1、探討“生物素化脂質(zhì)超聲微泡(Biotinylated microbubbles,MBb)”的制備方法,同步探討平行板流動腔法檢測MBb制備效果的可行性;2、探討應用生物素-親和素橋接法制備“攜羊抗小鼠IgG單抗超聲微泡(Microbubbles with monoclonal antibodies against mouse IgG,MB-IgG)”,并應用平行板流動腔法體外評價自制MB-IgG特異靶向粘附小鼠IgG的能力;3、應用生物素-親和素橋接法制備出“靶向小鼠P-選擇素超聲微泡(Microbubbles withmonoclonal antibodies against P-selectin,MBp)”,利用平行板流動腔模擬生理血流條件以評價其靶向粘附效能,為下一步在體評價血管內(nèi)皮炎癥及指導在體應用的環(huán)境范圍奠定基礎。 方法: 一、MBb的制備及應用平行板流動腔法評價MBb的制備效果 1、MBb的制備及理化性質(zhì)鑒定 通過聲振法制各出“普通脂質(zhì)微泡(Control lipid microbubbles,MB)”和“表面載有生物素脂質(zhì)的超聲微泡(MBb)”。庫爾特計數(shù)儀檢測微泡的粒徑分布及濃度,普通光學顯微鏡下動態(tài)觀察微泡的穩(wěn)定性;以大鼠腎臟模型評價MBb及MB的對比超聲(Contrast enhanced ultrasound,CEU)顯影效果;并用生物素-親和素橋接法在其表面連接上FITC標記的鏈親和素,熒光顯微鏡鏡下觀察微泡的熒光情況以確定微泡表面是否帶有生物素化脂質(zhì)。 2、平行板流動腔法評價MBb的制備效果 應用包被不同濃度鏈親和素的聚苯乙烯培養(yǎng)皿作為平行板流動腔體外檢測微泡粘附穩(wěn)定性的平臺。以包被高濃度鏈親和素(50μg/ml)的培養(yǎng)皿觀察普通脂質(zhì)微泡非特異性粘附效果為對照,分別采用鏈親和素高濃度包被(50μg/ml)、低濃度包被(5μg/ml)及空白培養(yǎng)皿檢測MBb粘附穩(wěn)定性,所有分組均按平行板流動腔實驗說明書要求檢測3個樣本;采用解離實驗,每30s倍增剪切應力(0.2-51.2dyn/cm~2),分別檢測各組微泡達半數(shù)解離時的剪切應力。 二、平行板流動腔體外評價MB-IgG的特異靶向粘附性能 1、制備表面載有生物素化脂質(zhì)的超聲微泡后,采用生物素-親和素橋接方法構(gòu)建MB-IgG,庫爾特計數(shù)儀檢測及顯微鏡下觀察微泡的粒徑分布和濃度。 2、CEU評價MB-IgG顯影效果:SD大鼠2只,進行下肢CEU,觀察下肢血管成像及肌肉灌注情況。 3、用平行板流動腔評價MB-IgG特異靶向粘附性能 在以不同濃度(10ng/ml、100ng/ml和1000ng/ml)小鼠IgG包被培養(yǎng)皿的平行板流動腔中,MB-IgG(5×10~6/ml)經(jīng)微量注射泵以固定剪切應力(0.3dyn/cm~2)通過,顯微鏡下觀察有微泡出現(xiàn)后開始錄像,分別檢測靶向微泡在不同時間點(1、2、3、4、5和6分鐘)結(jié)合于平行板流動腔中的數(shù)量,并以“1000ng/ml包被+大量羊抗小鼠IgG封閉(封閉組)”和“0ng/ml小鼠IgG包被(空白組)”,評價平行板流動腔法檢測MB-IgG的靶向粘附能力。各組樣本數(shù)均為3。 三、模擬生理血流條件下靶向P-選擇素微泡對P-選擇素的特異粘附效能 1、利用生物素-親和素橋接法構(gòu)建靶向小鼠P-選擇素超聲微泡(MBp),庫爾特計數(shù)儀檢測和顯微鏡下觀察微泡的粒徑分布及濃度。 2、平行板流動腔體外評價MBp靶向粘附效能 2.1、結(jié)合實驗:MBp(5×10~6/ml)經(jīng)微量注射泵以0.3dyn/cm~2剪切應力分別通過以不同濃度“小鼠P-選擇素Fc段(Recombinant Mouse P-Selectin/FcChimera,PS_(Fc))”包被(10-1000ng/ml)的平行板流動腔;自顯微鏡下觀察到有微泡出現(xiàn)后開始連續(xù)錄像6min,觀察每分鐘微泡的靶向結(jié)合情況;以“1000ng/mlPS_(Fc)包被+大量抗小鼠P-選擇素單抗封閉(封閉組)”和“0ng/ml PS_(Fc)包被(空白組)”為對照;在1000ng/ml PS_(Fc)包被組MBp還分別分6組以0.2、0.3、0.5、0.8、1.2和1.7dyn/cm~(2)通過平行板流動腔; 2.2、解離實驗:平行板流動腔以(10ng/ml、100ng/ml和1000ng/ml)PS_(Fc)包被,流動腔內(nèi)注入5×10~6/ml MBp約0.2ml后靜置5分鐘,先以0.9%生理鹽水(極低切應力0.2dyn/cm~2條件下)沖洗掉靜止但未結(jié)合的微泡,待鏡下無游離的微泡后,每30s逐漸增加剪切應力,直至微泡完全解離。20倍物鏡在固定的視野下全程錄像、拍照。 結(jié)果: 一、MBb的制備及應用平行板流動腔法評價MBb的制備效果 1、MBb的制備及理化性質(zhì)鑒定 1.1、采用聲振法制備的MB及MBb在顯微鏡下觀察均為透亮微氣泡,庫爾特計數(shù)儀檢測MB平均直徑為2.83μm,濃度為1.5×10~9個/ml,MBb平均直徑為2.71μm,濃度為1.3×10~9個/ml。所有微泡靜置過夜后均明顯分層,保存30天后觀察微泡形態(tài)及濃度無明顯改變 1.2、熒光顯微鏡檢查見生物素-親和素橋接法連接的FITC-鏈親和素熒光脂質(zhì)超聲微泡,大小均一、結(jié)構(gòu)完整并帶有均勻的綠色光環(huán),證實微泡表面成功攜帶生物素脂質(zhì)。 1.3、經(jīng)大鼠外周靜脈注射MBb及MB均能獲得滿意的大鼠腎臟超聲顯影。 2、平行板流動腔法評價MBb的制備效果 2.1、MBb可穩(wěn)定結(jié)合于鏈親和素包被的培養(yǎng)皿上,且其結(jié)合穩(wěn)定性隨著鏈親和素包被濃度的提高而增加(F=170.777,P＜0.01);對于高濃度鏈親和素包被組,使MBb半數(shù)解離剪切應力為(6.4-12.8)dyn/cm~2,當剪切應力達51.2dyn/cm~2時微泡才完全解離; 2.2、MBb在沒有包被鏈親和素的空白培養(yǎng)皿上,于低切應力條件下即見明顯的微泡解離,提示MBb不能穩(wěn)定結(jié)合于空白培養(yǎng)皿上; 2.3、MB在高濃度鏈親和素包被的培養(yǎng)皿上,于低切應力條件下即見明顯的微泡解離,說明MB難以穩(wěn)定結(jié)合于高濃度鏈親和素包被的培養(yǎng)皿表面。 二、平行板流動腔體外評價MB-IgG的靶向粘附效能 1、應用生物素-親和素橋接法成功制備MB-IgG,制備出的MB-IgG形狀、大小及濃度與MBb相似; 2、經(jīng)大鼠外周靜脈注射MB-IgG能獲得滿意的大鼠下肢血流及肌肉灌注顯影效果。 3、在0.3dyn/cm~2剪切應力的流體狀態(tài)下,MB-IgG可與小鼠IgG包被的平行板流動腔靶向結(jié)合,而封閉組及空白組在各時間點上均未見明顯靶向超聲微泡結(jié)合(3-11個/視野),不同濃度實驗組在各時間點上均可見不同程度的微泡結(jié)合(6-139個/視野),且包被濃度與觀察時間之間存在交互作用(F=148.523,P＜0.01),經(jīng)重復測量方差分析后并畫圖顯示其結(jié)合率隨著平行板流動腔上小鼠IgG包被濃度的提高而增加(F=282.171,P＜0.01)。 三、模擬生理血流條件下靶向P-選擇素微泡對P-選擇素的特異粘附效能 1、庫爾特計數(shù)儀檢測及顯微鏡下觀察 顯微鏡下MBb為透亮微氣泡,庫爾特計數(shù)儀檢測顯示其平均直徑2.71μm,濃度為1.3×10~9個/ml。制備出的MBp形狀無明顯變化、平均直徑為2.73μm,濃度為7.1×10~8個/ml。 2、靶向微泡的結(jié)合 2.1、平行板流動腔實驗顯示MBp可與PS_(Fc)包被的平行板流動腔靶向結(jié)合,在血流剪切應力為0.3dyn/cm~2,MBp經(jīng)過不同濃度PS_(Fc)包被的的平行板流動腔,重復測量方差分析顯示不同包被濃度與觀察時間之間存在交互作用(F=176.935,P＜0.01),MBp結(jié)合率隨著平行板流動腔上PS_(Fc)包被濃度的提高而增加(F=235.336,P＜0.01),MBp幾乎不能與空白培養(yǎng)皿結(jié)合,同樣,MBp也難以與被抗小鼠P-選擇素單克隆抗體封閉掉位點的PS_(Fc)結(jié)合。 2.2、PS_(Fc)包被濃度為1000ng/ml,給予6種剪切應力處理,可見MBp的靶向結(jié)合率受剪切應力影響,且不同剪切應力與觀察時間之間存在交互作用(F=108.936,P＜0.01),結(jié)合的微泡早期隨著剪切應力增大而增加,至0.5dyn/cm~2剪切應力作用時達最大結(jié)合,但隨著剪切應力繼續(xù)增加,微泡結(jié)合率下降,不同剪切應力處理組微泡結(jié)合率之間比較有顯著差異(F=150.364,P＜0.01)。 3、靶向微泡的解離 每30s增加一次剪切應力對微泡的沖刷以觀察鏡下仍結(jié)合的微泡,其中PS_(Fc)包被濃度與剪切應力間存在交互作用(F=48.167,P＜0.01),并可見MBp在高濃度PS_(Fc)包被的平行板更能抵抗血流剪切應力(F=297.615,P＜0.01),在濃度為1000ng/ml PS_(Fc)包被的平行板流動腔中,約9.6dyn/cm~2的剪切應力方能使結(jié)合的MBp半數(shù)解離。 結(jié)論: 一、應用聲振法制備生物素化脂質(zhì)微泡成功,此種微泡可通過生物素-親和素橋作用制備出攜帶各種靶分子的靶向微泡,為靶向超聲分子成像打下基礎。 二、成功建立應用平行板流動腔檢測生物素化脂質(zhì)微泡對鏈親和素的靶向粘附效果的方法學;該方法的建立對于在體外特異性的檢測靶向超聲微泡對靶分子的粘附效能有重要意義。 三、應用生物素-親和素橋接法構(gòu)建攜羊抗小鼠IgG單抗靶向微泡,并用平行板流動腔證實該微泡對小鼠IgG的特異靶向粘附作用,提示應用該構(gòu)建方法可以在生物素化脂微泡表面添加抗體。 四、應用生物素-親和素橋接法構(gòu)建了靶向P-選擇素的超聲微泡成功,并用平行板流動腔體外模擬生理血流條件評價攜抗小鼠P-選擇素靶向微泡對小鼠P-選擇素的靶向粘附效能。 五、平行板流動腔實驗證實靶向微泡的靶向能力受對應靶分子的表達濃度及剪切應力影響,使用該方法驗證可以得出靶向微泡在不同剪切應力下的靶向粘附能力,從而指導靶向微泡的在體應用的環(huán)境范圍。
【圖文】：

具有與紅細胞相似的流變學特征川，可順利的通過組織微循環(huán)又可與特異性靶向分子有效的結(jié)合，從而達到特異性地評價血循環(huán)內(nèi)皮細胞上分子學變化(或血循環(huán)內(nèi)固定的靶分子)的目的[2l(圖1)。.謐 ibodyor Otherligand\.咐igenpEG圖1特異性靶向超聲微泡與靶向組織細胞靶分子結(jié)合示意圖Fi到此ITa吧etedmia.bubbles別血姆h目totheta電etcells毫無疑問，必須要有一定數(shù)量的特異靶向性超聲微泡與組織細胞靶分子有效結(jié)合才能實現(xiàn)靶向超聲分子成像，因此，有效、特異的靶向超聲微泡的構(gòu)建是其中的關(guān)鍵。那么如何構(gòu)建靶向微泡?靶向微泡構(gòu)建完成后如何評價其構(gòu)建效果?是靶向微泡構(gòu)建過程中魚待解決的問題。構(gòu)建特異性靶向超聲微泡就是在脂質(zhì)或白蛋白外殼含氣體的微泡表面上裝配特異性配體�？贵w、多膚和多糖等多種分子物質(zhì)均可作為配體。靶向超聲微泡的骨架通常采用脂質(zhì)外殼含惰性氣體的微泡12.3】。其中，微泡與配體的連接技術(shù)是構(gòu)建靶向超聲微泡的核心，配體與微泡的連接可以通過非共價(Noncovalence)或共價(Covalence)連接。

前言目前，國外應用最廣泛的微泡與配體連接技術(shù)是非共價連接的生物素一親和素(Avidin一biotin)橋接法(圖2)。生物素一親和素橋接法的主要優(yōu)點是【2川:①為早期研究測試階段可快速的將各種新型配體連接至微泡上提供可行的方法，因為親和素與生物素有高度的親和力，可以在生理條件下與生物素迅速形成穩(wěn)定的結(jié)合;②通過選擇配體一微泡的適宜比例，可使加入的配體絕大部分連接到微泡上，結(jié)合效率高。國內(nèi)未見類似報道。A.d‘odyor“七口r梅.曰圖2生物素一親和素偶聯(lián)法構(gòu)建靶向微泡示意圖 Figure2Designofata飛 etedmicrobubbleviasto那tavidin一 intinsPa。汀靶向微泡構(gòu)建成功后，，必然涉及對其靶向粘附的特異性及效能進行評價，其中鼠提翠肌炎癥模型因為可以于在體顯微鏡下觀察熒光標記靶向微泡在微循環(huán)中對血管內(nèi)皮細胞表達的靶分子的靶向而被廣泛應用l5];然而，在體模型因受實驗動物體內(nèi)多種因素(如白細胞靶向161、吞噬作用閉等)的干擾，影響靶向微泡粘附特異性方面的評價;并且
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R445.1

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

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本文編號：2691242