【摘要】：研究背景: 血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)主要是由血管內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜、星形膠質(zhì)細(xì)胞終足構(gòu)成的一道擴(kuò)散屏障,幾乎存在于整個(gè)腦組織。腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞與身體其他部位內(nèi)皮細(xì)胞不同,細(xì)胞之間沒有孔隙,取而代之的是細(xì)胞間的緊密連接(tight junction,TJ)。腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞缺乏囊泡胞飲系統(tǒng)[1],但含有豐富的酶系統(tǒng),可以分解各種藥物及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),構(gòu)成了一道酶屏障[2]。正是由于腦內(nèi)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞這些特殊結(jié)構(gòu)使得BBB能在保護(hù)腦組織不受外界傷害性刺激影響的同時(shí)也將許多治療性藥物拒之門外[3]。因此近幾年開發(fā)了很多增加BBB通透性的方法來幫助藥物、抗體、基因成功地透過BBB進(jìn)入腦組織。有體外實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)超聲能夠用來打開血-組織屏障,使大分子和基因能夠穿過細(xì)胞質(zhì)膜[4]。此外高強(qiáng)度聚焦超聲也可以用于選擇性的開放大鼠BBB。在超聲照射前給予一定量微泡造影劑,因?yàn)槌暱栈说囊肟梢越档统曢_放BBB時(shí)所需要的超聲能量,從而可以減少組織損害的風(fēng)險(xiǎn)并使該技術(shù)能夠通過完整的顱骨實(shí)施BBB能夠可逆性的開放BBB而不引起神經(jīng)細(xì)胞的急性損傷。而目前尚無診斷超聲聯(lián)合超聲造影劑SonoVue開放血腦屏障的報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)就將就這一空白進(jìn)行研究,并進(jìn)一步探討SonoVue介導(dǎo)UC開放BBB的安全性。 目的 首先驗(yàn)證超聲造影劑聲諾維(SonoVue)介導(dǎo)診斷超聲(diagnostic ultrasound,DU)增加大鼠BBB通透性的可行性與可逆性,同時(shí)進(jìn)行動(dòng)脈血?dú)夥治鰴z測(cè)該方法是否會(huì)對(duì)大鼠循環(huán)系統(tǒng)產(chǎn)生影響。隨后使用組織學(xué)染色來觀察本實(shí)驗(yàn)條件的超聲造影(ultrasonic contrast,UC)是否會(huì)造成大鼠神經(jīng)細(xì)胞的壞死及紅細(xì)胞的滲出。最后通過Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)(Morris water maze, MWM)來檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能進(jìn)一步評(píng)估本實(shí)驗(yàn)開放BBB方法的安全性。 方法 實(shí)驗(yàn)一、SonoVue介導(dǎo)DU開放大鼠BBB可行性和可逆性研究以及對(duì)大鼠動(dòng)脈血?dú)獾挠绊?1.SonoVue介導(dǎo)DU開放大鼠BBB可行性 根據(jù)處理方法的不同將32只大鼠隨即分為四組,每組8只:Con組大鼠僅進(jìn)行麻醉、備皮、靜脈置管,而不進(jìn)行其他操作直接給予伊文思藍(lán)(Evens blue,EB);單純超聲組動(dòng)物進(jìn)行麻醉、備皮、靜脈置管后給予生理鹽水,然后進(jìn)行超聲10min,并同時(shí)注射EB;單純?cè)煊皠┙M大鼠在麻醉、備皮、靜脈置管后直接給予SonoVue,10min后靜脈注射EB;UC組大鼠在進(jìn)行麻醉、備皮、靜脈置管后,靜脈注射SonoVue同時(shí)開始UC10min,超聲結(jié)束即刻給予EB。 2.SonoVue介導(dǎo)DU開放大鼠BBB的可逆性 為確定BBB開放是否可逆,根據(jù)時(shí)間不同又將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為4組:2h、4h、6h、8h組,分別于UC后的2h、4h、6h、8h注射EB檢測(cè)當(dāng)時(shí)BBB開放情況,每組SD大鼠8只。 3.SonoVue介導(dǎo)DU開放BBB對(duì)大鼠動(dòng)脈血?dú)獾挠绊?隨機(jī)抽取8只進(jìn)行UC的大鼠,每只大鼠分別于UC前、UC5min、UC后即刻抽取動(dòng)脈血1ml檢測(cè)其動(dòng)脈血PO2、PCO2、PH等指標(biāo)。 實(shí)驗(yàn)二SonoVue介導(dǎo)DU開放BBB對(duì)大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞的影響 三只雄性SD大鼠經(jīng)UC開放BBB后取腦切片進(jìn)行HE染色,在顯微鏡下觀察神經(jīng)細(xì)胞是否有壞死及是否有紅細(xì)胞滲出。 實(shí)驗(yàn)三SonoVue介導(dǎo)DU開放BBB對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為三組,每組8只大鼠:Con組,該組大鼠不做任何處理直接進(jìn)行MMW;假手術(shù)組,該組大鼠僅進(jìn)行麻醉、備皮、靜脈置管,而不給予UC,并于麻醉后24h開始進(jìn)行MWM實(shí)驗(yàn);UC組:該組大鼠進(jìn)行麻醉、備皮、靜脈置管、給予UC,并于超聲后24h開始進(jìn)行MWM實(shí)驗(yàn)。 結(jié)果 1. SonoVue可以介導(dǎo)DU局灶性的開放大鼠BBB,主要表現(xiàn)在超聲輻照區(qū)局部EB滲出;且這一通透性的改變是可逆的,BBB的開放可以持續(xù)4h。 2.大劑量SonoVue不會(huì)影響大鼠動(dòng)脈血?dú)獾淖兓?3.本實(shí)驗(yàn)參數(shù)不會(huì)對(duì)超聲輻照區(qū)域大鼠神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生損害,不會(huì)造成腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損害使紅細(xì)胞滲出。 4.通過對(duì)大鼠進(jìn)行MWM實(shí)驗(yàn)可觀察到UC開放BBB后的大鼠在定位航行實(shí)驗(yàn)中與Con組和Sham組相比逃逸潛伏期縮短,上臺(tái)前距離縮短;在最后一天空間探索實(shí)驗(yàn)中的目標(biāo)象限停留時(shí)間延長(zhǎng)。證明UC開放BBB后的大鼠其空間學(xué)習(xí)與記憶能力都有所提高。 結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)首先通過EB滲透法證明超聲造影劑聲諾維介導(dǎo)診斷超聲可以局部開放大鼠BBB,且BBB通透性的增加可以持續(xù)4h。同時(shí)使用腦組織HE染色來觀察超聲造影不會(huì)造成大鼠神經(jīng)細(xì)胞的壞死也不會(huì)造成超聲照射區(qū)紅細(xì)胞的滲出。MWM實(shí)驗(yàn)證明大鼠在超聲造影后空間學(xué)習(xí)記憶功能都有所提高。因此我們可以得出本實(shí)驗(yàn)所使用的UC參數(shù)可以靶向性、可逆性開放BBB且不會(huì)對(duì)CNS結(jié)構(gòu)和功能以及大鼠動(dòng)脈血?dú)庠斐刹涣加绊憽?br>【圖文】：

圖 1 、BBB 的超微結(jié)構(gòu)常生理功能的發(fā)展，人們對(duì)BBB的認(rèn)識(shí)的不斷加深，BBB已經(jīng)包面的含義了：1.保護(hù)腦組織不受血液中有害物質(zhì)的損2.保護(hù)腦組織不受身體其他部位的激素或神經(jīng)傳導(dǎo)物是被動(dòng)保護(hù)性屏障，還能選擇性地將腦內(nèi)有害或過剩的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。4.BBB還具有體液調(diào)節(jié)功能并遵循Sta水壓力下進(jìn)人腦組織的水分，都將由被BBB阻滯于毛漿蛋白形成的滲透壓所建立起的一種反向力量將其重有效地控制水分及其溶質(zhì)進(jìn)入腦組織[10]。在病理情況素影響下，BBB容易遭到破壞這種調(diào)控作用消失，表中的成分包括電解質(zhì)和血漿蛋白被血液壓力經(jīng)開放的

圖 2、Con 組與 UC 開放 BBB 組大鼠腦 EB 的滲出3.3 大腦中 EB 含量如表 3 所示，與對(duì)照組相比，，單純超聲組和單純給予 SonoVue 組大鼠腦內(nèi) EB 含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而給予 UC 后即刻組 EB 滲出最多，2h 組和 4h組 EB 含量有所下降但仍能檢測(cè)到。而 6h 組和 8h 組 EB 含量與對(duì)照組相比已無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表 3 大鼠腦中 EB 含量（n= 8 ， ±s）EB 吸光度值 腦重 g EB 含量 μg/gcon 0.0352±0.00606 1.3705±0.12534 0.4138±0.10104DU 0.0378±0.00976 1.4149±0.12987 0.4392±0.15468SonoVue 0.0395±0.00843 1.4118±0.11342 0.4563±0.100720h 0.2970±0.08894 1.3968±0.09015 4.1841±1.22986*
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R445.1

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