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白介素-1β對(duì)膿毒癥新生幼鼠胼胝體內(nèi)少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞分化成熟的影響及機(jī)制探討

發(fā)布時(shí)間:2017-09-21 13:52

  本文關(guān)鍵詞:白介素-1β對(duì)膿毒癥新生幼鼠胼胝體內(nèi)少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞分化成熟的影響及機(jī)制探討


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【摘要】:新生兒膿毒血癥是臨床常見的重癥疾病,可引起神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育不良,甚至腦癱。近年來有研究表明感染激發(fā)腦內(nèi)炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致腦室周邊腦白質(zhì)損傷(Periventicular White Matter Damage,PWMD)的機(jī)制之一,腦白質(zhì)損傷可出現(xiàn)髓鞘完整性的破壞及神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)異常,這可能是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育不良的機(jī)制之一。髓鞘的完整性是神經(jīng)電信號(hào)高效傳導(dǎo)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),其形成過程包括少突膠質(zhì)細(xì)胞的幼稚細(xì)胞,即少突前體細(xì)胞(Oligodendrcyte Precuror Cells,OPCs)的成熟發(fā)育、發(fā)育成熟的神經(jīng)元軸突、兩者相互纏繞、粘附。其中OPCs是構(gòu)成髓鞘的重要細(xì)胞,OPCs的發(fā)育過程比較復(fù)雜,包括(1)O-2A前體細(xì)胞時(shí)期;(2)O-2A祖細(xì)胞時(shí)期;(3)少突前體時(shí)期;(4)不成熟少突時(shí)期;(5)成熟少突時(shí)期。有研究表明少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞較神經(jīng)元細(xì)胞更易損傷,因此機(jī)體內(nèi)環(huán)境的變化可能會(huì)引起OPCs分化障礙。小膠質(zhì)細(xì)胞是大腦中的免疫細(xì)胞,當(dāng)它暴露于LPS和缺氧的情況下,會(huì)迅速釋放過多的炎癥介質(zhì),改變了靶細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境。這些因子干擾了正常的軸突髓鞘化過程和成熟型OPCs(預(yù)OLS)產(chǎn)生。有研究發(fā)現(xiàn)缺氧導(dǎo)致的腦內(nèi)炎癥可以引起軸突髓鞘化障礙,可能由于炎癥因子及其相應(yīng)受體相互作用引起,如白介素-1β (Interleukin-1β,IL-1β)和IL-1R1 (IL-1 recptor 1),但炎癥因子的具體作用及機(jī)制尚不明確。有研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)注射IL-1β可引小鼠的幼鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育障礙,導(dǎo)致軸突低髓鞘化,但具體機(jī)制不明,且是否存在種屬差異并不明確。IL-1β在OPCs的發(fā)育中起何種作用,IL-1R抑制劑是否有其臨床應(yīng)用價(jià)值,需要進(jìn)一步的研究來探討。本研究旨在探討膿毒癥對(duì)新生大鼠OPCs發(fā)育的影響及IL-1p在其中的作用及機(jī)制探討。因此,進(jìn)行腹腔注射LPS誘導(dǎo)膿毒癥大鼠模型,觀察膿毒癥大鼠胼胝體內(nèi)IL-1p的表達(dá)及OPCs早期凋亡與增殖以及后期分化及軸突髓鞘化情況,從而證實(shí)膿毒癥新生大鼠出現(xiàn)OPCs的發(fā)育障礙。為了明確IL-1β在OPCs發(fā)育中扮演的角色,我們進(jìn)行OPCs的體外培養(yǎng),觀察IL-1β對(duì)OPCs增殖,凋亡及分化的影響,進(jìn)一步探討IL-1p影響OPCs分化的可能機(jī)制。第一章LPS對(duì)胼胝體內(nèi)炎癥因子及其受體表達(dá)的影響目的:探討LPS是否影響胼胝體內(nèi)炎癥因子白介素-1β (Interleukin-1 beta, IL-1β)及其受體IL-1R1 (IL-1 receptor 1)的表達(dá)。方法:構(gòu)建膿毒癥新生幼鼠模型,使用新生1天的SD乳鼠,實(shí)驗(yàn)組腹腔注射1mg/kg的LPS,對(duì)照組注射等體積的生理鹽水。與母鼠同籠共養(yǎng)至7d,取3h, 1d,3d,7d的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),利用免疫熒光及免疫印跡和PCR的方法檢測(cè)IL-1p和IL-1R1的表達(dá)情況。選擇0.25mg/mg,0.5mg/kg,1mg/kg,2mg/kg,4mg/kg, 8mg/kg6種濃度梯度進(jìn)行注射,然后進(jìn)行7天存活率和體重的粗略估計(jì),篩選出成活率最高的0.25mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg,然后根據(jù)體重變化及1天,3天IL-1β和IL-1R1的表達(dá)情況,確定為lmg/kg最為適宜。在確定最佳LPS劑量后,驗(yàn)證LPS是否增加炎癥因子IL-1β及其受體IL-1R1的表達(dá),分為生理鹽水對(duì)照組及LPS組,取3h,1d,3d,7d幾個(gè)時(shí)間點(diǎn),在進(jìn)行相應(yīng)處理后利用免疫熒光,免疫印跡及PCR的方法檢測(cè)腦胼胝體內(nèi)IL-1β及IL-1R1的表達(dá)及定位情況。結(jié)果:等待孕鼠生產(chǎn),生仔約8-15只不等,將新生1d的SD乳鼠,體重約5-7g,分別注射LPS及生理鹽水,對(duì)照組處理1d后體重約7-9g,3d后約12-13g,7d后約18-20g,0.25mg/kg的LPS注射1d后體重為8-9g,3天后為12-13g,7d后為18-20g,與對(duì)照組無差別,棄去此劑量。0.5mg/kg LPS注射1d后體重為7-9g,3天后為11-13g,7d后為16-19g,與對(duì)照組差別不大,棄去此劑量。1mg/kgLPS注射1d后體重為6-7.5g(死亡率10%),3天后為8-10g(死亡率40%),7d后為12-13g,2mg/kg LPS注射1d后體重為6-7.5g(死亡率20%),3天后為8-10g(死亡率80%),7d后為12-13g,4mg/kg LPS注射1d后體重為6-7.5g(死亡率40%),3天后為8-10g(死亡率100%),7d無存活,8mg/kg LPS注射1d后體重為6-7.5g(死亡率80%),3天后為8-10g(死亡率100%),7d無存活,按模型的成功性及穩(wěn)定性選取lmg/kg LPS腹腔注射。根據(jù)上述篩選結(jié)果,后續(xù)免疫熒光、免疫蛋白印跡、PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)lmg/kgLPS處理3h,1d,3d,7d后的胼胝體內(nèi)炎癥因子IL-1β及其受體IL-1R1表達(dá)較對(duì)照組明顯增加(P0.05)。結(jié)論:LPS可引起胼胝體內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活并釋放大量炎癥介質(zhì)IL-1p,在少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(OPCs)上存在IL-1R1及受體表達(dá)增加。第二章膿毒癥模型對(duì)OPCs凋亡及增殖分化的影響目的:探討lmg/kg LPS注射后對(duì)OPCs凋亡和增殖及分化的影響。方法:利用雙標(biāo)免疫熒光的方法探討膿毒癥模型對(duì)OPCs凋亡及增殖的影響。將新生1d的SD乳鼠處理后,分為對(duì)照組及LPS組,與母鼠同籠共養(yǎng)至28d,取1d,3d,7d,14d,28d的胼胝體進(jìn)行觀察。檢測(cè)Cleaved-Caspase-3(細(xì)胞凋亡標(biāo)記物)和BrdU(細(xì)胞增殖標(biāo)記物)的表達(dá)。利用雙標(biāo)免疫熒光、WB及PCR的方法探討膿毒癥模型對(duì)OPCs分化的影響。將新生1d的SD乳鼠處理后,分為對(duì)照組及LPS組,與母鼠同籠共養(yǎng)至28d,取7d,14d,28d的胼胝體進(jìn)行觀察。檢測(cè)幼稚少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物PDGFRa和NG2的的表達(dá)情況,檢測(cè)成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物MBP及CNPase的表達(dá)情況。檢測(cè)OPCs特異性因子Olig1以及Olig2的表達(dá)情況。結(jié)果:與對(duì)照組相比,OPCs在1d,3d,7d時(shí)凋亡細(xì)胞數(shù)增多而增殖細(xì)胞數(shù)降低,免疫熒光實(shí)驗(yàn)及免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)表明PDGFRa和NG2在7d時(shí)較對(duì)照組減少,14d及28d時(shí)較對(duì)照組增多,而MBP及CNPase表達(dá)較對(duì)照組降低,7d,14d,28d胼胝體內(nèi)Olig1和Olig2表達(dá)量較對(duì)照組降低。結(jié)論:LPS所誘導(dǎo)的膿毒癥模型促進(jìn)了早期OPCs的凋亡,抑制了早期OPCs的增殖及分化。第三章 膿毒癥模型對(duì)胼胝體內(nèi)軸突髓鞘化的影響目的:探討膿毒癥模型對(duì)胼胝體內(nèi)軸突髓鞘化的影響。方法:使用透射電鏡進(jìn)行探究。將新生1d的SD乳鼠處理后,分為對(duì)照組及LPS組,與母鼠同籠共養(yǎng)至28d,取28d的胼胝體進(jìn)行電鏡觀察。檢測(cè)胼胝體內(nèi)有髓神經(jīng)纖維的數(shù)目及髓鞘的厚度。結(jié)果:與對(duì)照組相比,28d時(shí)LPS組胼胝體內(nèi)有髓神經(jīng)纖維的數(shù)目及髓鞘的厚度均降低(*P0.05)。結(jié)論:LPS誘導(dǎo)的膿毒癥模型可以導(dǎo)致軸突低髓鞘化。第四章 IL-1β對(duì)OPCs凋亡與增殖及分化的影響目的:探討IL-1β對(duì)OPCs凋亡及增殖及分化的影響。方法:取新生1天SD乳鼠的腦皮層進(jìn)行混合細(xì)胞培育,使用少突前體增殖培育基,增殖培育7天,然后分組后增殖1天,分為對(duì)照組(PBS組)、30ng/ml IL-1β組、30ng/ml IL-1β+30ng/ml IL-1Ra組(IL-1Ra,IL-1R的特異性拮抗劑)。進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)凋亡及增殖情況。取新生1天SD乳鼠的腦皮層進(jìn)行混合細(xì)胞培育,使用少突前體增殖培育基,增殖培育7天,然后消化后種相同數(shù)量的細(xì)胞分組培育,分為對(duì)照組(PBS組)、30ng/ml IL-1β組、30ng/ml IL-1β+30ng/ml IL-1Ra組(IL-1Ra,IL-1R的特異性拮抗劑)、30ng/ml IL-1Ra組。更換少突膠質(zhì)細(xì)胞分化培養(yǎng)基分化培養(yǎng)3天,各組處理3d后進(jìn)行免疫熒光及免疫蛋白印跡檢測(cè)細(xì)胞分化情況。結(jié)果:三組凋亡無差別。IL-1β組增殖的OPCs數(shù)較對(duì)照組及IL-1β+IL-1Ra組減少。免疫熒光顯示與對(duì)照組相比,處理3d后IL-1β組幼稚的OPCs細(xì)胞數(shù)增多(NG2標(biāo)記)。與IL-1β組相比,IL-1β+IL-1Ra組幼稚的OPCs細(xì)胞數(shù)有所減少。與對(duì)照組相比,IL-1β組成熟的OPCs減少(MBP標(biāo)記)。與IL-1β組相比,IL-1β+IL-1Ra組成熟的OPCs較前增多。WB顯示與對(duì)照組相比,IL-1p組NG2、PDGFRa表達(dá)升高,而MBP、CNPase、Olig1、Olig2表達(dá)降低,與IL-1p組相比,IL-1β+IL-1Ra組NG2、PDGFRa表達(dá)有所降低,MBP、CNPase、Olig1、 Olig2表達(dá)有所回升,而IL-1Ra與對(duì)照組相比各項(xiàng)指標(biāo)表達(dá)無差別。結(jié)論:IL-1β可抑制OPCs增殖及分化,但未對(duì)OPCs凋亡過程產(chǎn)生影響。第五章IL-1β對(duì)FYN-MEK-ERK通路的影響及兩者調(diào)控OPCs分化的關(guān)系目的:探討IL-1p對(duì)FYN-MEK-ERK通路的影響及兩者調(diào)控OPCs分化的關(guān)系。方法:(1)取新生1天SD乳鼠的腦皮層進(jìn)行混合細(xì)胞培育,使用少突前體增殖培育基,增殖培育7天,增殖后,消化后種相同細(xì)胞數(shù),使用少突膠質(zhì)細(xì)胞分化培養(yǎng)基進(jìn)行分化培養(yǎng)6h,各組處理6h后用WB法觀察磷酸化FYN,磷酸化MEK,磷酸化ERK表達(dá)。分為對(duì)照組(PBS組)、30ng/ml IL-1 β組、30ng/ml IL-1β+30ng/ml IL-1Ra (IL-lRa,IL-1R的特異性拮抗劑)。(2)構(gòu)建ERK質(zhì)粒,進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,分為對(duì)照組(PBS組)、30ng/ml IL-1β組、ERK目的基因組、30ng/ml IL-1β+ERK目的基因組、空載體pEGFP組。此5組進(jìn)行分化3d后進(jìn)行免疫蛋白印跡檢測(cè)(Western blotting, WB)觀察NG2、PDGFRa、Olig1、Olig2、 MBP、CNPase表達(dá)情況。結(jié)果:(1)與對(duì)照組相比,處理6h后IL-1β組磷酸化-FY-N,磷酸化-MEK,磷酸化-ERK的表達(dá)有所降低。(2)與IL-1β組相比,IL-1β+IL-1Ra組磷酸化-FYN,磷酸化-MEK,磷酸化-ERK的表達(dá)有所回升。(3)與IL-1β組相比,IL-1β+ERK基因組幼稚標(biāo)志物NG2、PDGFRα降低,成熟標(biāo)志物MBP、CNPase、Olig1、 Olig2表達(dá)升高。結(jié)論:IL-1β可能通過抑制ERK通道來調(diào)控OPCs的分化。
【關(guān)鍵詞】:少突膠質(zhì)細(xì)胞 小膠質(zhì)細(xì)胞 LPS IL-1β FYN ERK
【學(xué)位授予單位】:南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2015
【分類號(hào)】:R720.597
【目錄】:
  • 摘要3-8
  • ABSTRACT8-18
  • 前言18-20
  • 第一章 LPS對(duì)胼胝體內(nèi)炎癥因子及其受體表達(dá)的影響20-35
  • 1. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>20
  • 2. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料20-22
  • 2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物20
  • 2.2 實(shí)驗(yàn)材料20-21
  • 2.3 試劑準(zhǔn)備21-22
  • 3. 實(shí)驗(yàn)方法22-27
  • 3.1 最佳模型制作22-23
  • 3.2 LPS對(duì)腦胼胝體內(nèi)IL-1β及IL-1R_1表達(dá)的影響23-27
  • 3.4 統(tǒng)計(jì)方法27
  • 4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果27-34
  • 4.1 模型篩選結(jié)果27-28
  • 4.2 LPS對(duì)腦胼胝體內(nèi)IL-1β表達(dá)的影響28-31
  • 4.3 LPS對(duì)腦胼胝體內(nèi)IL-1R_1表達(dá)的影響31-34
  • 5. 討論34
  • 6. 結(jié)論34-35
  • 第二章 膿毒癥模型對(duì)OPCs凋亡及增殖及分化的影響35-51
  • 1. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>35
  • 2. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料35-36
  • 2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物35
  • 2.2 實(shí)驗(yàn)材料35-36
  • 3. 實(shí)驗(yàn)方法36-40
  • 3.1 探討LPS對(duì)胼胝體內(nèi)OPCs凋亡的影響36
  • 3.2 探討LPS對(duì)胼胝體內(nèi)OPCs增殖的影響36
  • 3.3 免疫熒光法檢測(cè)NG2、PDGFRα、MBP、CNPse的表達(dá)情況36-37
  • 3.4 WB檢測(cè)LPS對(duì)腦胼胝體內(nèi)NG2、PDGFRα、MBP、CNPase、Olig1、Olig2的表達(dá)情況37-39
  • 3.5 RT-PCR法檢測(cè)LPS對(duì)腦胼胝體Olig1、Olig2、Nkx2.2、Tcf4、Axin39-40
  • 3.6 統(tǒng)計(jì)方法40
  • 4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果40-49
  • 4.1 LPS注射后各時(shí)間點(diǎn)OPCs細(xì)胞的凋亡情況40-42
  • 4.2 LPS注射后各時(shí)間點(diǎn)OPCs細(xì)胞的增殖情況42-43
  • 4.3 免疫熒光檢測(cè)NG2、PDGFRα的表達(dá)43-46
  • 4.4 MBP及CNPse的表達(dá)46-47
  • 4.5 Olig1、Olig2、Nkx2.2、Tcf4、Axin2的表達(dá)47-49
  • 5. 討論49-51
  • 6. 結(jié)論51
  • 第三章 膿毒癥模型對(duì)胼胝體內(nèi)軸突髓鞘化的影響51-55
  • 1. 目的51
  • 2. 實(shí)驗(yàn)試劑及材料51-52
  • 2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物51
  • 2.2 實(shí)驗(yàn)材料51-52
  • 3. 實(shí)驗(yàn)方法52-53
  • 3.1 標(biāo)本留取52
  • 3.2 統(tǒng)計(jì)方法52-53
  • 4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果53-54
  • 4.1 膿毒癥模型對(duì)胼胝體內(nèi)軸突髓鞘化的影響53-54
  • 5. 討論54
  • 6. 結(jié)論54-55
  • 第四章 IL-1β對(duì)OPCs凋亡與增殖及分化的影響55-65
  • 1. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>55
  • 2. 實(shí)驗(yàn)試劑及材料55-56
  • 2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物55
  • 2.2 實(shí)驗(yàn)試劑55-56
  • 3. 實(shí)驗(yàn)方法56-59
  • 3.1 OPCs細(xì)胞的獲取56-57
  • 3.2 免疫熒光檢測(cè)OPCs的增殖與凋亡情況及細(xì)胞鑒定57
  • 3.4 免疫熒光檢測(cè)OPCs的分化情況及細(xì)胞鑒定57-58
  • 3.5 WB檢測(cè)NG2、PDGFRα、MBP、CNPase、Olig1、Olig2表達(dá)58-59
  • 4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果59-64
  • 4.1 IL-1β對(duì)OPCs凋亡的影響60-61
  • 4.2 IL-1β對(duì)OPCs增殖的影響61-62
  • 4.3 免疫熒光檢測(cè)NG2及MBP的表達(dá)及細(xì)胞鑒定62-64
  • 5. 討論64-65
  • 6. 結(jié)論65
  • 第五章 IL-1β對(duì)FYN-MEK-ERK通路的影響及兩者調(diào)控OPCs分化的關(guān)系65-73
  • 1. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>65
  • 2. 實(shí)驗(yàn)試劑及材料65-66
  • 3. 實(shí)驗(yàn)方法66-69
  • 3.1 OPCs細(xì)胞的獲取66-67
  • 3.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染67
  • 3.3 WB檢測(cè)NG2、PDGFRα、MBP、CNPase、Olig1、Olig2、磷酸化FYN、磷酸化MEK、磷酸化ERK的表達(dá)67-69
  • 4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果69-71
  • 4.1 IL-1β對(duì)FYN-MEK-ERK通路的影響69-70
  • 4.2 IL-1β與ERK通道在調(diào)控OPCs分化中的關(guān)系70-71
  • 5. 討論71-72
  • 6. 結(jié)論72-73
  • 全文總結(jié)73-74
  • 參考文獻(xiàn)74-79
  • 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文79-80
  • 致謝80-81

【共引文獻(xiàn)】

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 郭星;巖茶提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠視網(wǎng)膜光損傷保護(hù)及其機(jī)制的研究[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2013年



本文編號(hào):894912

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