本文關(guān)鍵詞：表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）對人肝癌細胞的抑制作用

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【摘要】：肝癌是世界上最常見的五大惡性腫瘤之一，肝癌的死亡率占癌癥死亡率的第三位。手術(shù)治療目前是治療肝癌的有效方式，但對于癌轉(zhuǎn)移病人的治療效果有限。如果找到能夠具有抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移雙重功能的藥物，對于癌癥的早期治療以及配合手術(shù)治療的藥物治療將具有重要意義。已有研究表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin gallate， EGCG)能抑制一些癌細胞的轉(zhuǎn)移和誘導(dǎo)癌細胞凋亡，故本實驗選用具有高轉(zhuǎn)移性質(zhì)的人肝癌細胞HCCLM6作為體外模型，研究EGCG的體外抗腫瘤作用。本實驗的目的是從細胞凋亡、細胞轉(zhuǎn)移、蛋白質(zhì)組學方面探討EGCG對肝癌細胞的抑制作用，并對其抑制作用機制進行了初步研究,為今后的動物實驗和臨床應(yīng)用提供參考。 首先，本課題從誘導(dǎo)細胞凋亡的角度檢測EGCG對人肝癌細胞HCCLM6和人正常肝細胞HL7702的抑制作用，并探討EGCG誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡的分子機制。MTT法檢測EGCG對HCCLM6細胞和HL7702細胞增殖的抑制作用；流式細胞術(shù)檢測EGCG對HCCLM6細胞和HL7702細胞凋亡率、細胞周期和線粒體膜電位的影響;Western-bloting檢測EGCG對HCCLM6細胞和HL7702細胞Bcl-2，NF-kB，Bax, P53,caspase-9，caspase-3和cytochrome-c蛋白表達的影響。結(jié)果顯示EGCG(10-100μg/ml)能顯著抑制HCCLM6細胞的增殖作用并呈一定的劑量依賴性；EGCG從80μg/ml開始對HL7702細胞有顯著抑制作用。EGCG（10，30μg/ml）可以誘導(dǎo)肝癌細胞HCCLM6凋亡，降低其線粒體膜電位，阻滯細胞周期于G0/G1期；EGCG（10，30μg/ml）不能誘導(dǎo)人正常肝細胞HL-7702的凋亡，對其線粒體膜電位和細胞周期也沒有明顯影響。該濃度下EGCG處理HCCLM6細胞后，Bcl-2和NF-kB蛋白表達顯著下降,Bax,P53,caspase-3和caspase-9蛋白的表達顯著升高，cytochrome-c由線粒體向細胞質(zhì)釋放；但EGCG作用前后HL-7702細胞后這些蛋白的表達均無明顯影響。這些結(jié)果表明EGCG可以選擇性作用于肝癌細胞，同時不影響正常肝細胞的功能。EGCG主要通過線粒體途徑引起HCCLM6細胞凋亡。所以在誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡方面，，EGCG可以作為一個潛在的治療肝癌的藥物。 其次，本研究旨在檢測EGCG對HCCLM6細胞轉(zhuǎn)移的抑制作用，并探討EGCG抑制HCCLM6細胞轉(zhuǎn)移的作用機制。用體外遷移和侵襲實驗?zāi)MHCCLM6細胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)移行為，檢測EGCG對細胞轉(zhuǎn)移的影響;用明膠酶譜法和RT-PCR法探討EGCG抑制HCCLM6細胞轉(zhuǎn)移的機制。遷移和侵襲實驗結(jié)果顯示EGCG(5，10μg/ml）能顯著抑制HCCLM6細胞的侵襲和遷移；明膠酶譜法顯示EGCG(5，10，20μg/ml）能顯著抑制HCCLM6細胞中MMP-2和MMP-9的活性；RT-PCR結(jié)果表明EGCG(10，20μg/ml）能顯著抑制HCCLM6細胞中MMP-2和MMP-9的mRNA水平。推測MMP-2和MMP-9的活性的降低可能與EGCG抑制HCCLM6細胞轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究顯示EGCG具有抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的功能，提示EGCG可能成為一個治療肝癌的潛在藥物。 最后，為進一步探討EGCG對HCCLM6細胞的抑制作用機制，本課題采用蛋白質(zhì)組學方法，對EGCG作用HCCLM6細胞前后進行蛋白質(zhì)組學分析，發(fā)現(xiàn)了35個蛋白點在EGCG處理后發(fā)生可重復(fù)的顯著變化，其中11個蛋白點被上調(diào)，24個被下調(diào)。選4個變化明顯的差異蛋白點，經(jīng)MALDI-TOF/MS分析，利用得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行肽指紋圖譜分析后，被鑒定為FUBP1, HSPB1, NPM和CH60。已有文獻報道這四種蛋白與細胞的轉(zhuǎn)移和凋亡有關(guān)，故推測EGCG通過下調(diào)FUBP1、HSPB1、CH60的表達、上調(diào)NPM的表達來引起HCCLM6細胞凋亡和（或）抑制細胞的轉(zhuǎn)移。蛋白質(zhì)組學研究結(jié)果印證了前期實驗結(jié)果對EGCG對于肝癌細胞作用機制的推測。
【關(guān)鍵詞】：肝腫瘤 表沒食子兒茶素沒食子酸酯 凋亡 轉(zhuǎn)移 蛋白質(zhì)組學
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 摘要9-11
• Abstract11-13
• 前言13-14
• 第一部分表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)誘導(dǎo)人肝癌細胞和正常肝細胞凋亡功效的比較14-30
• 材料14-16
• 1 實驗材料14-16
• 1.1 細胞株14
• 1.2 藥物與試劑14-15
• 1.3 器材15-16
• 方法16-21
• 2 實驗方法16-21
• 2.1 細胞培養(yǎng)16
• 2.2 MTT 法檢測 EGCG 對細胞生長的抑制作用16-17
• 2.3 細胞核形態(tài)的觀察17
• 2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞周期17-18
• 2.5 細胞凋亡測定18-19
• 2.6 線粒體膜電位的測定19
• 2.7 Western-blotting 測蛋白表達19-20
• 2.8 統(tǒng)計學分析20-21
• 結(jié)果21-27
• 討論27-29
• 小結(jié)29-30
• 第二部分 表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)對人肝癌細胞轉(zhuǎn)移的抑制作用30-42
• 材料30-31
• 1 實驗材料30-31
• 1.1 細胞株30
• 1.2 試劑30
• 1.3 器材30-31
• 方法31-36
• 2 實驗方法31-36
• 2.1 細胞培養(yǎng)31
• 2.2 侵襲實驗31
• 2.3 遷移實驗31-32
• 2.4 明膠酶譜法測金屬蛋白酶的活性32
• 2.5 RT- P C R32-34
• 2.6 免疫熒光技術(shù)檢測肝癌細胞 VEGF 和 OPN 的表達34-35
• 2.7 統(tǒng)計學分析35-36
• 結(jié)果36-40
• 討論40-41
• 小結(jié)41-42
• 第三部分 表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)對人肝癌細胞蛋白質(zhì)組學的影響42-49
• 材料42-43
• 1 實驗材料42-43
• 1.1 細胞株42
• 1.2 藥物與試劑42
• 1.3 器材42-43
• 方法43-45
• 2 實驗方法43-45
• 2.1 細胞培養(yǎng)43
• 2.2 分組43
• 2.3 細胞全蛋白樣品制備43
• 2.4 蛋白濃度測定43
• 2.5 蛋白質(zhì)的純化43
• 2.6 等電聚焦電泳43-44
• 2.7 SDS-PAGE 電泳44
• 2.8 凝膠的銀染44
• 2.9 凝膠圖像的分析44
• 2.10 質(zhì)譜分析44-45
• 結(jié)果45-47
• 討論47-48
• 小結(jié)48-49
• 結(jié)論49-50
• 參考文獻50-55
• 綜述55-63
• 參考文獻59-63
• 附錄63-64
• 致謝64-65

【參考文獻】

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本文編號：796678