本文關(guān)鍵詞：兒童Alport綜合征的臨床及遺傳學特征研究

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【摘要】：研究背景Alport綜合征(Alport sydrome, AS)是一種常見的遺傳性腎小球疾病,以持續(xù)性血尿、晶體及眼底改變、高頻神經(jīng)性耳聾及進行性腎功能衰竭為主要臨床特征。AS有3種不同的遺傳方式,85%為X連鎖顯性遺傳(X-linked Inheritance AS, XLAS),由編碼α5鏈的COL4A5基因突變所致,病變基因定位于Xq21-q22;15%是常染色體隱性遺傳(Autosomal Recessive Inheritance, ARAS),其致病基因是COL4A3或COL4A4基因,病變基因定位于2q35-q37；罕見的有常染色體顯性遺傳(Autosomal dominant inheritance AS, ADAS),致病基因亦為COL4A3或COL4A4基因。過去認為AS為一種罕見病,早期調(diào)查發(fā)現(xiàn)AS的發(fā)病率為1：5000～10000我國大樣本資料顯示,全國兒科2315例行腎活檢的患者中,AS占1.2%,隨著診斷技術(shù)的進步以及對遺傳病認識的提高和重視,臨床上可見越來越多有關(guān)AS的報道。AS目前尚無特異性的根治方法,患兒多進展至終末期腎功能不全。在兒童終末期腎病(End-stage Renal Disease, ESRD)中,AS患兒約占3%。因其危害性極大,越來越引起臨床醫(yī)生的關(guān)注。但AS患兒發(fā)病隱匿、臨床表現(xiàn)多樣,相當一部分患兒臨床表現(xiàn)不典型,臨床醫(yī)師極易漏診或誤診,且AS預后較差,因此早期鑒別和診斷AS具有重要的臨床意義。目前認為對于AS診斷較為可靠的標準為3條：電鏡下腎小球基底膜(glomerular basement membrane, GBM)出現(xiàn)典型的超微結(jié)構(gòu)改變；皮膚或腎組織基底膜Ⅳ型膠原α鏈表達異常；COL4A5/3/4基因突變。臨床上30%的AS患者基底膜Ⅳ型膠原α鏈可無缺失表達,目前該現(xiàn)象并無確切的機制進行闡述,推測是因為某些突變對Ⅳ型膠原α鏈的結(jié)構(gòu)和功能影響不大所致。AS患兒在疾病早期,電鏡下腎小球基底膜可表現(xiàn)正�；騼H表現(xiàn)為彌漫性變薄,并非所有AS均表現(xiàn)為GBM彌漫厚薄不均、分層甚至斷裂等特征性病理改變。因此,對于基底膜Ⅳ型膠原α鏈表達正�；螂婄R下GBM未出現(xiàn)典型超微病變者,亦不能輕易排除AS。對于AS而言,臨床表現(xiàn)以及腎組織(或皮膚)的Ⅳ型膠原α鏈染色及腎組織電鏡檢查僅為AS的診斷提供輔助資料,確診該病最可靠的標準是基因診斷。AS相關(guān)致病基因有3個,分別為COL4A5基因(51個外顯子)、COL4A3基因(52個外顯子),COL4A4基因(48個外顯子),因其外顯子數(shù)目龐大且無熱點突變,基因診斷并未廣泛開展。傳統(tǒng)的Sanger法測序認為是遺傳病基因診斷的“金標準”,但其耗時、費力且價格昂貴,對于外顯子數(shù)目龐大的AS致病基因并不適用。第二代高通量基因測序(Next generation squencing, NGS)較以往的測序技術(shù)而言,具有高通量、速度快、低成本的特點,利用NGS一方面能檢測出遺傳病已知的致病基因,另一方面還可發(fā)現(xiàn)未知致病基因突變或新的基因突變位點。國內(nèi)采用該技木對AS家系進行研究的報道較少,多為病例報導或少數(shù)家系的基因突變分析。因此,本研究通過收集30例疑似及確診AS的患兒,通過完善腎臟病理、臨床表現(xiàn)及基因檢測等資料,確立AS患兒的個體化診斷,進一步分析AS患兒的基因突變及臨床表型特征,明確AS基因突變類型,豐富AS基因突變數(shù)據(jù)庫,為AS深入的發(fā)病機制探討提供基礎工作。另外研究中檢測到兩例患兒存在同義突變,分別為c.3246GA (p.1082KK)、 c.465GA (p.155KK),更新了傳統(tǒng)認為“同義突變不致病”的觀念,為同義突變的功能驗證研究提供了依據(jù)。目的本研究通過收集30例疑似及確診AS的患兒,通過收集AS患兒家系的臨床資料,初步分析AS臨床表型的特點；通過完善腎臟病理、臨床表現(xiàn)及基因檢測等資料,確立AS患兒的個體化診斷,豐富AS的診斷深度；分析AS患兒的基因突變數(shù)據(jù),明確AS基因突變類型,豐富AS基因突變數(shù)據(jù)庫,為AS深入的發(fā)病機制探討提供基礎工作。方法選取2005年1月至2015年10月在南京總醫(yī)院兒科病區(qū)住院確珍或疑似AS的30例患兒為研究對象。通過基因測序后所有患兒均符合AS診斷標準。收集患兒及家系中患者的性別、起病方式、眼耳病變情況、腎臟損傷表現(xiàn)等資料；收集腎組織病理資料,包括腎組織光鏡、免疫熒光、電鏡及腎組織基底膜Ⅳ型膠原檢查結(jié)果,對AS患兒的臨床表現(xiàn)進行初步分析。經(jīng)征得本院倫理委員會批準,患兒家長同意并簽署知情同意書后,收集30個AS家系成員的外周血標本,應用二代測序外顯子序列捕獲技術(shù),對30個疑似和確診AS患兒的全外顯子組基因進行測序,分別設計針對突變位點的引物對其直系家屬進行Sanger測序驗證。通過dbSNP數(shù)據(jù)庫、人類基因突變及相關(guān)基本疾病數(shù)據(jù)庫(HMGD數(shù)據(jù)庫)等公共數(shù)據(jù)庫的過濾篩選突變基因,經(jīng)SIFT軟件對突變基因位點進行蛋白功能預測。對基因突變結(jié)果進行分析,確立AS患兒個性化的診斷體系。通過家系分析對AS雙基因模式進行初步探討。本研究統(tǒng)計分析均采用SPSS19.0軟件進行。計量資料以均數(shù)±標準差(x±S)表示,兩獨立樣本采用t檢驗,多組獨立樣本采用單因素方差分析；計數(shù)資料以率表示,采用Fisher確切概率法。以a=0.05作為檢驗水準,P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果1 AS患兒臨床表型的初步分析30例患兒均有不同程度的血尿(100%),鏡下血尿者19例(63.33%),男性患兒15例,女性患兒4例；肉眼血尿者11例(36.67%),男性患兒5例,女性患兒6例。不同性別患兒間血尿程度無統(tǒng)計學差異(P=0.108)。鏡下血尿者發(fā)病年齡為1月～10歲,平均發(fā)病年齡2.86±2.46歲；肉眼血尿者發(fā)病年齡為1歲～6歲,2.55±1.29歲。兩者發(fā)病年齡無統(tǒng)計學差異(t=0.388,P=0.701)合并蛋白尿者23例(76.67%),男17例,女6例,無蛋白尿者7例(23.33%),男3例,女4例。根據(jù)24小時尿蛋白定量結(jié)果,將伴有不同程度蛋白尿的患兒分為四組,A組為陰性組,B組為少量蛋白尿組,C組為中等量蛋白尿組,D組為大量蛋白尿組。其中A組7例(23.33%),男3例,女4例；B組4例(13.33%),男3例,女1例；C組15例(50%),男12例,女3例；D組4例(13.33%),男2例,女2例。四組間男女患兒的構(gòu)成比無統(tǒng)計學差異(P=0.322)。A組患兒平均發(fā)病年齡為2.71±1.11歲,B組患兒平均發(fā)病年齡4.05±2.85歲,C組患兒平均發(fā)病年齡為2.47±2.47歲,D組患兒平均發(fā)病年齡為2.50±0.58歲,四組間患兒的發(fā)病年齡無統(tǒng)計學差異(P=0.621)。30例患兒腎功能均處于CKD 1期,腎外表現(xiàn)少見,僅1例男性患兒(6.25%)9歲時檢測出雙側(cè)對稱性感音神經(jīng)性,輕度聽力下降23例患兒行腎穿刺活檢,腎小球微小病變(MCD)13例(56.5%),系膜增生性腎小球腎炎(MsPNG)10例(43.5%),23例患兒均通過腎組織冰凍切片間接免疫熒光法檢測腎組織Ⅳ型膠原α3、α5鏈表達,其中完全或部分表達缺失19例(82.6%),另4例患兒腎組織Ⅳ型膠原α3、α5鏈表達正常。9例患兒(39.1%)電鏡結(jié)果見基膜致密層分層撕裂,呈“花籃樣”改變,基膜厚薄不一等AS典型電鏡改變,另2例表現(xiàn)為薄基底膜病,6例表現(xiàn)為系膜增生性改變,6例無腎小球。2 AS患兒的基因突變的測序和分析30例AS患兒,共檢測出35個COL4A5/3/4基因突變位點,其中包括錯義突變19個、同義突變2個、剪切位點突變4個、無義突變3個、插入突變2個、缺失突變4個、復雜突變1個。共發(fā)現(xiàn)COL4A5基因突變24個、COL4A3基因突變6個、COL4A4基因突變5個。通過Sanger測序?qū)蚁党蓡T進行驗證,結(jié)果發(fā)現(xiàn)20例突變來源于母親,8例突變來源于父親,8例為新生突變,1例先證者純合基因突變分別來自父母雙方,1例患兒突變來源不詳。本研究共發(fā)現(xiàn)31例突變類型未見疾病報道。結(jié)合患兒臨床表現(xiàn)、腎組織病理檢查、家族史調(diào)查、基因突變分析,所有患兒均能明確診斷為AS。兩例患兒(成員1、25)檢測到COL4A5基因同義突變,分別為c.3246GA(p.1082KK)、c.465GA(p.155KK),經(jīng)家系分析認為兩個同義突變均具有致病性。XLAS患兒共26例,男性患兒16例,女性患兒10例。15例患兒的基因突變類型為錯義突變(57.69%),2例為無義突變(7.69%),3例為剪切位點突變(13.04%),2例為插入突變(7.69%),2例為缺失突變(7.69%),2例為同義突變(7.69%)。不同突變類型家系患病成員進展至ESRD的年齡差異差異有統(tǒng)計學意義(P=0.018),錯義突變進展至ESRD的速度較無義突變、剪切位點突變、框移突變緩慢。XLAS男性患者比女性患者更早進展至ESRD,兩者發(fā)病年齡差異有統(tǒng)計學意義(P=0.043)。此外研究還發(fā)現(xiàn)5例患兒合并2個AS致病基因突變(成員1、5、9、12、25),但并不支持Mencarelli等[4]首次提出AS存在雙基因遺傳模式的論斷成立；結(jié)論1 本研究中AS患兒發(fā)病年齡小,血尿為最常見的首發(fā)癥狀,均未進展至腎功能不全,腎外表現(xiàn)少見；AS早期腎組織病理光鏡表現(xiàn)輕微且無特異性,主要以MCD為主；電鏡表現(xiàn)常不典型,Ⅳ型膠原α鏈免疫熒光染色亦存在局限性,僅根據(jù)患兒的臨床表型及腎組織病理結(jié)果,有可能漏診或誤診；2基因檢測完善了AS患兒的個體化診斷體系,有助于AS的早期診斷；明確AS基因突變類型,豐富AS基因突變數(shù)據(jù)庫,為AS深入的發(fā)病機制探討提供基礎工作；3基因檢測有利于判斷AS患兒的預后情況,不同遺傳型及不同基因突變類型的患兒預后均不一致；4通過家系分析,暫不支持AS存在雙基因遺傳模式。
【關(guān)鍵詞】：Alport綜合征 基因診斷 突變 基因型 臨床表型
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R726.9
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-17
• 前言17-20
• 第一章 Alport綜合征患兒臨床資料的收集和初步分析20-35
• 1 研究對象20
• 2 研究方法20-21
• 2.1 主要試劑20
• 2.2 主要實驗儀器20
• 2.3 統(tǒng)計學分析20-21
• 3 病例資料收集21
• 4 輔助檢查21-23
• 4.1 尿液檢查21
• 4.2 腎功能檢查21-22
• 4.3 聽力檢查22
• 4.4 眼部檢查22-23
• 4.5 腎臟組織病理檢查23
• 5 結(jié)果23-30
• 5.1 一般情況23-24
• 5.2 腎臟表現(xiàn)24-26
• 5.3 腎外表現(xiàn)26
• 5.4 腎組織病理情況26-30
• 6 討論30-34
• 7 結(jié)論34-35
• 第二章 Alport綜合征患兒的基因突變的測序和分析35-63
• 1 主要實驗試劑、儀器35-36
• 1.1 主要試劑35
• 1.2 主要儀器35-36
• 1.3 生物信息學途徑和計算機分析軟件36
• 2 實驗方法36-40
• 2.1 標本收集和保存36
• 2.2 DNA提取36-37
• 2.3 全外顯子組捕獲與測序37-38
• 2.4 生物信息分析38-39
• 2.5 Sanger測序驗證39-40
• 3 基因檢測結(jié)果40-49
• 3.1 錯義突變41-44
• 3.2 同義突變44
• 3.3 剪切位點突變44-45
• 3.4 無義突變45-46
• 3.5 插入突變46
• 3.6 缺失突變46-47
• 3.7 復雜突變47-49
• 4 AS的個體化診斷49-52
• 5 基因型和臨床表型的關(guān)系研究52-55
• 5.1 AS不同基因突變類型的臨床特點比較52-53
• 5.2 AS不同遺傳方式的臨床特點比較53-55
• 6 AS雙基因模式探討55-59
• 7 討論59-62
• 8 結(jié)論62-63
• 參考文獻63-69
• 附錄69-70
• 攻讀碩士學位期間成果70-71
• 致謝71-72

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