本文關(guān)鍵詞：一種防治柯薩奇病毒感染的新方法的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：柯薩奇病毒(Coxsackie Virus,CV)是一種人類病毒,其歸屬在小RNA病毒科(Picornaviridas)中的腸道病毒屬(Enterovirus,EV)。本研究中用到的是柯薩奇病毒的一種很重要的亞型之一,柯薩奇病毒B組3型病毒(coxsackievirus B3,CVB3)。它在臨床上能引起急慢性心肌炎和胰腺炎,發(fā)病率和病死率很高,特別是對(duì)于嬰幼兒及新生兒來說是高易感疾病[1],新生兒及幼兒的病患較多,嚴(yán)重威脅著嬰幼兒的健康及生存。雖然成人患病相對(duì)較少,但是一旦發(fā)病,同樣非常嚴(yán)重,而且至今沒有特效的藥物或防治措施。因此,本研究針對(duì)CVB3感染的防治策略進(jìn)行了探索,希望能探究出一條新的比較有效的防治途徑。本研究首先用基因合成、拼接等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法對(duì)天然Caspase-3進(jìn)行了改造,設(shè)計(jì)出了含3C蛋白酶酶切位點(diǎn)的Caspase-3的基因,成功構(gòu)建了3C蛋白酶.重組Caspase-3細(xì)胞凋亡通路,利用3C蛋白酶的酶切活性在細(xì)胞內(nèi)激活Caspase-3信號(hào)凋亡通路,從而誘導(dǎo)感染細(xì)胞發(fā)生凋亡。該工作分別構(gòu)建了真核表達(dá)載體,即質(zhì)粒、腺病毒表達(dá)載體和慢病毒表達(dá)載體,遞送入哺乳細(xì)胞內(nèi),檢測(cè)了其表達(dá)產(chǎn)物及細(xì)胞毒性。之后分別在哺乳動(dòng)物細(xì)胞及Balb/c乳鼠上進(jìn)行防治CVB3感染效果的驗(yàn)證。結(jié)果顯示,重組Caspase-3對(duì)細(xì)胞感染CVB3具有保護(hù)作用,并且對(duì)Balb/c乳鼠感染CVB3也具有保護(hù)作用。同時(shí),為了這條途徑最終能應(yīng)用于人類病毒感染的防治,以求找出最佳的基因載體能起到更好的防治病毒的效果。我們對(duì)Caspase-3進(jìn)一步地改造,成功構(gòu)建了質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-recombination-signal peptide-caspase-3-6Aa(以下簡(jiǎn)稱為p-rc-sig-6),又相繼獲得了含有改造Caspase-3的基因的腺病毒基因載體Ad-recombination-Caspase-3-6Aa( 以下簡(jiǎn)稱為Ad-rc-6)和Ad-recombination-Caspase-3-8Aa(以下簡(jiǎn)稱為Ad-rc-8)及慢病毒基因表達(dá)載體LV-recombination-signal peptide-Caspase-3-6Aa(以下簡(jiǎn)稱為L(zhǎng)V-rc-sig-6)。我們首先在哺乳動(dòng)物細(xì)胞上進(jìn)行了質(zhì)粒、腺病毒基因載體及慢病毒基因載體的表達(dá)驗(yàn)證及抑制病毒感染的驗(yàn)證,繼而又在乳鼠身上進(jìn)行了腺病毒基因載體及慢病毒基因載體抑制病毒感染的驗(yàn)證,證實(shí)了這條通路是可行的,并且還具有廣泛的實(shí)用性。我們?cè)诖俗龀隽艘恍┨剿?希望能為以后這條通路應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)提供一些參考。這條通路的提出,為CVB3感染的防治及其治療藥物的研發(fā)提供了新的途徑和思路,同時(shí)也為其它病毒的防治方法提供了借鑒意義,具有十分廣闊的應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：柯薩奇病毒 防治 3C蛋白酶 caspase-3 基因載體 凋亡信號(hào)通路
【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R725.1
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 英文縮略詞表10-11
• 前言11-21
• 1 病毒與宿主的相互作用11-12
• 2 柯薩奇病毒概述12-13
• 3 Caspase-3概述13-15
• 4 3C蛋白酶概述15-16
• 5 防治CVB_3感染的研究現(xiàn)狀16
• 6 基因載體應(yīng)用概述16-17
• 7 本課題的研究?jī)?nèi)容和意義17-21
• 第一章 質(zhì)粒p-rc-sig-6、腺病毒Ad-rc-6和Ad-rc-8及慢病毒LV-rc-sig-6基因載體的構(gòu)建21-35
• 1.1 材料、試劑及儀器21-24
• 1.1.1 引物、載體、質(zhì)粒21-22
• 1.1.2 培養(yǎng)基22-23
• 1.1.3 主要試劑及耗材23
• 1.1.4 主要溶液23
• 1.1.5 儀器設(shè)備23-24
• 1.2 研究方法24-31
• 1.2.1 p-rc-sig-6表達(dá)載體的構(gòu)建24-31
• 1.3 研究結(jié)果31-32
• 1.3.1 獲得了重組質(zhì)粒p-rc-sig-631-32
• 1.4 本章小結(jié)32
• 1.5 討論32-35
• 第二章 上述3類基因載體的表達(dá)檢測(cè)、對(duì)細(xì)胞活性的影響以及對(duì)細(xì)胞感染CVB_3的防治效果的研究35-57
• 2.1 材料、試劑及儀器35-37
• 2.1.1 表達(dá)載體、qPCR引物、菌株、細(xì)胞35-36
• 2.1.2 培養(yǎng)基和胰酶36
• 2.1.3 主要試劑及耗材36
• 2.1.4 主要溶液36-37
• 2.1.5 儀器設(shè)備37
• 2.2 研究方法37-43
• 2.2.1 Hela細(xì)胞培養(yǎng)37
• 2.2.2 凍存細(xì)胞株37-38
• 2.2.3 復(fù)蘇細(xì)胞株38
• 2.2.4 細(xì)胞總RNA的提取及純化38-39
• 2.2.5 反轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse Transcription,RT-PCR)39-40
• 2.2.6 Real-time實(shí)時(shí)熒光定量PCR40-41
• 2.2.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染41-42
• 2.2.8 CVB_3病毒的擴(kuò)增及濃縮42
• 2.2.9 CVB_3病毒的滴度測(cè)定42-43
• 2.2.10 CVB_3病毒感染細(xì)胞43
• 2.3 研究結(jié)果43-53
• 2.3.1 質(zhì)�；蜉d體p-rc-6,p-rc-sig-6導(dǎo)入Hela細(xì)胞后的轉(zhuǎn)錄檢測(cè)43-44
• 2.3.2 腺病毒基因載體Ad-rc-6和Ad-rc-8導(dǎo)入Hela細(xì)胞后的轉(zhuǎn)錄檢測(cè)44-45
• 2.3.3 慢病毒載體LV-rc-sig-6導(dǎo)入Hela細(xì)胞后的轉(zhuǎn)錄檢測(cè)45-46
• 2.3.4 轉(zhuǎn)進(jìn)腺病毒載體Ad-rc-6的Hela細(xì)胞的顯微照片46-47
• 2.3.5 轉(zhuǎn)進(jìn)慢病毒載體LV-rc-sig-6的Hela細(xì)胞的顯微照片47
• 2.3.6 質(zhì)粒p-Cas-3,p-rc-6,p-rc-8的轉(zhuǎn)染對(duì)Hela細(xì)胞活性無影響47-48
• 2.3.7 腺病毒載體Ad-rc-6和Ad-rc-8的導(dǎo)入對(duì)Hela細(xì)胞活性無影響48-49
• 2.3.8 慢病毒載體LV-rc-sig-6的導(dǎo)入對(duì)Hela細(xì)胞活性無影響49-50
• 2.3.9 計(jì)算得出了CVB_3病毒的滴度50-51
• 2.3.10 質(zhì)粒p-rc-6和p-rc-8具有保護(hù)細(xì)胞群的作用51-52
• 2.3.11 腺病毒載體Ad-rc-6和Ad-rc-8具有保護(hù)細(xì)胞群的作用52-53
• 2.4 本章小結(jié)53
• 2.5 討論53-57
• 第三章 腺病毒基因載體Ad-rc-6和Ad-rc-8及慢病毒LV-rc-sig-6對(duì)乳鼠感染CVB3的防治效果57-69
• 3.1 材料、試劑及儀器57-58
• 3.1.1 病毒,基因載體及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物57
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)耗材57-58
• 3.1.3 實(shí)驗(yàn)環(huán)境及設(shè)備58
• 3.2 研究方法58-59
• 3.2.1 腹腔注射腺病毒載體Ad-rc-6及Ad-rc-8及CVB_358
• 3.2.2 口腔灌胃腺病毒載體Ad-rc-6及Ad-rc-8及CVB_358
• 3.2.3 腹腔注射慢病毒載體LV-precas3-c6及CVB_358-59
• 3.3 研究結(jié)果59-65
• 3.3.1 建立了CVB3感染乳鼠的模型59-60
• 3.3.2 腺病毒載體Ad-rc-6及Ad-rc-8的轉(zhuǎn)導(dǎo)能幫助乳鼠防御CVB_3感染60-63
• 3.3.3 慢病毒載體LV-precas3-c6的轉(zhuǎn)導(dǎo)能幫助乳鼠防御CVB_3感染63-65
• 3.4 本章小結(jié)65
• 3.5 討論65-69
• 結(jié)論69-71
• 附錄71-73
• 參考文獻(xiàn)73-79
• 攻讀碩士期間發(fā)表的文章79-81
• 致謝81-82

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

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  本文關(guān)鍵詞：一種防治柯薩奇病毒感染的新方法的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：327186