本文關(guān)鍵詞：乳凝集素改善壞死性小腸結(jié)腸炎腸道通透性及損傷修復(fù)的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎(Necrotizing enterocolitis,NEC)是早產(chǎn)兒常見的消化道進(jìn)展性疾病,其發(fā)病機(jī)制不明,但與腸道屏障功能破壞密切相關(guān)。課題組前期實(shí)驗(yàn)證明,乳凝集素可通過調(diào)節(jié)腸道緊密連接蛋白,降低大鼠腸道屏障的通透性。本研究擬通過檢測乳凝集素對腸道緊密連接蛋白(Claudin-3和Occludin)的表達(dá)和分布,及腸道屏障修復(fù)相關(guān)蛋白(TLR4)表達(dá)等的影響,探討乳凝集素在改善NEC中的作用及可能機(jī)制。方法:第一部分動物實(shí)驗(yàn):(1)動物分組:一日齡新生大鼠被分為母乳組(DF組)、NEC模型組(N組)和NEC+rh MFG-E8組(N+M組),采用缺氧冷應(yīng)激+配方奶侵襲性喂養(yǎng)的方法建立NEC模型,而N+M組在建立NEC模型的基礎(chǔ)上予以rh MFG-E8 100μg/天。(2)小腸形態(tài)學(xué)檢查:喂養(yǎng)96h后,處死新生大鼠,并觀察腸道外觀形態(tài),取小腸回盲部組織,進(jìn)行組織病理學(xué)以及透射電鏡檢查。(3)腸道通透性檢測:各組新生大鼠于喂養(yǎng)結(jié)束后予以FITC標(biāo)記的葡聚糖(FD10S),5h后采血,檢測血清中FITC的濃度來評估腸道屏障通透性。(4)腸道緊密連接蛋白表達(dá)分布水平檢測:通過Western blot、q RT-PCR和免疫組化的方法檢測小腸回盲部CLDN3和Occludin的分布情況。(5)腸道TLR4表達(dá)水平檢測:通過Western blot和q RT-PCR檢測小腸回盲部TLR4的表達(dá)情況。第二部分細(xì)胞實(shí)驗(yàn):(1)細(xì)胞分組:將IEC-6細(xì)胞分為PBS組(P組,對照組)、LPS組(L組,添加LPS 50μg/ml)和LPS+rh MFG-E8組(L+M組,在LPS組的基礎(chǔ)上添加rh MFG-E8 2μg/ml)。(2)細(xì)胞通透性檢測:利用transwell小室構(gòu)建單層細(xì)胞模型,分組培養(yǎng)24h后上室內(nèi)添加FD10S,5h后取下室內(nèi)液體檢測FD10S的濃度評價(jià)各組細(xì)胞通透性。(3)細(xì)胞緊密連接蛋白的表達(dá)分布水平:細(xì)胞分組后培養(yǎng)24h,采取免疫熒光、Western blot和q RT-PCR檢查觀察CLDN3、Occludin和ZO-1蛋白的表達(dá)分布情況。(4)劃痕實(shí)驗(yàn):細(xì)胞分組后,采取劃痕的方法構(gòu)建模型,記錄各組細(xì)胞于不同時(shí)間點(diǎn)(0h,6h,12h和24h)的遷移距離,評估遷移能力。結(jié)果:第一部分動物實(shí)驗(yàn):(1)乳凝集素對NEC新生大鼠臨床癥狀的影響N組的新生大鼠最早出現(xiàn)喂養(yǎng)不耐受(包括胃殘余量增加,進(jìn)奶量下降等)、大便性狀改變等癥狀。添加rh MFG-E8后,與N組相比較,新生大鼠的胃殘余量減少,進(jìn)奶量增加。(2)乳凝集素對NEC新生大鼠小腸回盲部形態(tài)學(xué)影響與N組相比較,添加rh MFG-E8的N+M組新生大鼠小腸回盲部輕中度積氣,未見節(jié)段性黑紅色壞死灶,其組織病理學(xué)評分及NEC陽性率顯著降低(P0.05)。透射電鏡下,N組新生大鼠小腸回盲部腸黏膜隱窩部上皮細(xì)胞空泡化明顯,細(xì)胞質(zhì)呈深色,胞漿濃縮,細(xì)胞體積縮小,細(xì)胞間結(jié)構(gòu)松散,可見典型凋亡細(xì)胞。而N+M組僅見細(xì)胞核染色質(zhì)出現(xiàn)不同程度的積聚,核膜邊集,線粒體腫脹。(3)乳凝集素對NEC新生大鼠腸道通透性及CLDN3、Occludin和TLR4表達(dá)分布的影響與N組相比較,N+M組新生大鼠腸道通透性顯著降低(P0.05),CLDN3胞內(nèi)分布由胞漿內(nèi)彌散分布變?yōu)樵诎ど蠞饩�。同時(shí),其小腸回盲部TLR4表達(dá)水平較N組顯著降低(P0.05)。第二部分細(xì)胞實(shí)驗(yàn):(1)乳凝集素對LPS處理后IEC-6細(xì)胞通透性和緊密連接蛋白表達(dá)分布水平的影響與LPS組相比較,L+M組表觀滲透系數(shù)(Papp)顯著降低(P0.05),趨近P組,其CLDN3的表達(dá)水平顯著降低(P0.05),同時(shí)ZO-1由胞漿內(nèi)彌散分布變?yōu)樵诎ど蠞饩郾磉_(dá)。(2)乳凝集素對LPS處理后IEC-6細(xì)胞遷移能力的影響與LPS組相比較,添加rh MFG-E8的L+M組于給藥后12h時(shí)間點(diǎn)的水平遷移距離顯著增加(P0.05),趨近P組。結(jié)論:(1)乳凝集素能夠改善NEC新生大鼠小腸回盲部外觀形態(tài)、組織學(xué)評分及超微結(jié)構(gòu),降低NEC的發(fā)生率和嚴(yán)重程度。(2)乳凝集素能使NEC新生大鼠小腸回盲部CLDN3蛋白重新分布,使其在細(xì)胞膜上濃聚,同時(shí)降低TLR4的表達(dá)水平,從而降低腸道通透性,提高腸道損傷修復(fù)能力,維持腸道屏障的穩(wěn)態(tài)。(3)乳凝集素能降低LPS處理后的IEC-6細(xì)胞CLDN3蛋白表達(dá)水平,同時(shí)使ZO-1蛋白重新分布,使其在細(xì)胞膜上濃聚,從而改善細(xì)胞通透性。(4)乳凝集素能增強(qiáng)經(jīng)LPS處理后IEC-6細(xì)胞的遷移能力,從而促進(jìn)腸上皮細(xì)胞修復(fù)能力。
【關(guān)鍵詞】：壞死性小腸結(jié)腸炎 乳凝集素 腸道通透性 緊密連接 遷移
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R722.6
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-14
• 中英文縮略詞表14-15
• 緒論15-18
• 第一部分 乳凝集素對新生大鼠壞死性小腸結(jié)腸炎腸道屏障通透性及損傷修復(fù)相關(guān)蛋白TLR4的影響18-46
• 1.1 材料和方法18-31
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物18
• 1.1.2 儀器設(shè)備18-19
• 1.1.3 試劑耗材19-20
• 1.1.4 試劑配備20-22
• 1.1.5 實(shí)驗(yàn)方法22-31
• 1.1.5.1 重組人乳凝集素的表達(dá)和純化22
• 1.1.5.2 NEC新生大鼠模型的制備22-23
• 1.1.5.3 實(shí)驗(yàn)動物分組23-24
• 1.1.5.4 腸道通透性檢測24
• 1.1.5.5 動物實(shí)驗(yàn)取材24
• 1.1.5.6 新生大鼠小腸回盲部組織形態(tài)學(xué)分析24-27
• 1.1.5.6.1 新生大鼠小腸回盲部組織HE染色檢查24-26
• 1.1.5.6.2 新生大鼠小腸回盲部透射電鏡檢查26-27
• 1.1.5.7 新生大鼠小腸回盲部免疫組化檢查27-28
• 1.1.5.8 新生大鼠小腸回盲部Western blot檢測28-30
• 1.1.5.9 新生大鼠小腸回盲部real-time PCR檢測30-31
• 1.1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析31
• 1.2 結(jié)果31-42
• 1.2.1 乳凝集素對NEC新生大鼠臨床癥狀的影響31
• 1.2.2 乳凝集素對NEC新生大鼠小腸回盲部形態(tài)學(xué)影響31-35
• 1.2.2.1 乳凝集素對NEC新生大鼠小腸回盲部外觀形態(tài)的影響31-32
• 1.2.2.2 乳凝集素對NEC新生大鼠小腸回盲部HE染色的影響32-34
• 1.2.2.3 乳凝集素對NEC新生大鼠小腸回盲部超微結(jié)構(gòu)的影響34-35
• 1.2.3 乳凝集素對NEC新生大鼠腸道屏障的影響35-42
• 1.2.3.1 乳凝集素對NEC新生大鼠腸道通透性的影響35
• 1.2.3.2 乳凝集素對NEC新生大鼠小腸回盲部腸道緊密連接蛋白CLDN3和Occludin表達(dá)分布的影響35-40
• 1.2.3.2.1 乳凝集素對NEC新生大鼠小腸回盲部緊密連接蛋白CLDN3表達(dá)分布的影響35-38
• 1.2.3.2.2 乳凝集素對NEC新生大鼠小腸回盲部緊密連接蛋白Occludin表達(dá)分布的影響38-40
• 1.2.3.3 乳凝集素對NEC新生大鼠小腸回盲部TLR4表達(dá)的影響40-42
• 1.2.3.3.1 乳凝集素對NEC新生大鼠小腸回盲部TLR4蛋白表達(dá)的影響40-41
• 1.2.3.3.2 乳凝集素對NEC新生大鼠小腸回盲部TLR4 mRNA表達(dá)的影響41-42
• 1.3 討論42-46
• 第二部分 乳凝集素對LPS處理后IEC-6 細(xì)胞屏障通透性及細(xì)胞遷移能力的影響46-66
• 2.1 材料和方法46-54
• 2.1.1 儀器設(shè)備46-47
• 2.1.2 試劑耗材47-48
• 2.1.3 試劑配備48-50
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)方法50-54
• 2.1.4.1 重組人乳凝集素的表達(dá)和純化50
• 2.1.4.2 IEC-6 細(xì)胞株的培養(yǎng)傳代50
• 2.1.4.3 細(xì)胞分組50
• 2.1.4.4 單層IEC-6 細(xì)胞通透性檢測50-51
• 2.1.4.5 劃痕實(shí)驗(yàn)51
• 2.1.4.6 細(xì)胞Western blot檢測51-52
• 2.1.4.7 細(xì)胞real-time PCR檢測52-53
• 2.1.4.8 細(xì)胞免疫熒光檢測53-54
• 2.1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析54
• 2.2 結(jié)果54-64
• 2.2.1 乳凝集素對LPS處理后IEC-6 細(xì)胞屏障的影響54-63
• 2.2.1.1 乳凝集素對LPS處理后IEC-6 細(xì)胞通透性的影響54-55
• 2.2.1.2 乳凝集素對LPS處理后IEC-6 細(xì)胞緊密連接蛋白CLDN3、Occludin和ZO-1 表達(dá)分布的影響55-63
• 2.2.1.2.1 乳凝集素對LPS處理后IEC-6 細(xì)胞緊密連接蛋白CLDN3表達(dá)分布的影響55-58
• 2.2.1.2.2 乳凝集素對LPS處理后IEC-6 細(xì)胞緊密連接蛋白Occludin表達(dá)分布的影響58-61
• 2.2.1.2.3 乳凝集素對LPS處理后IEC-6 細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1 表達(dá)分布的影響61-63
• 2.2.2 乳凝集素對LPS處理后IEC-6 細(xì)胞遷移能力的影響63-64
• 2.3 討論64-66
• 結(jié)論66-67
• 參考文獻(xiàn)67-71
• 致謝71-73
• 附錄一：綜述73-84
• 參考文獻(xiàn)79-84
• 附錄二：已刊文章目錄84

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 謝婷;高峻;李兆申;;腸道通透性研究進(jìn)展[J];國際消化病雜志;2008年02期

2 薛建中;;燒傷后病人腸道通透性立即增加[J];國外醫(yī)學(xué).創(chuàng)傷與外科基本問題分冊;1991年01期

3 ;膽汁郁積性黃疸時(shí)腸道通透性增加和粘膜免疫狀況的變化[J];國外醫(yī)學(xué).外科學(xué)分冊;1998年04期

4 董紅林;;腸道通透性試驗(yàn)及其臨床意義[J];世界華人消化雜志;2000年05期

5 金希;厲有名;虞朝輝;呂國才;徐磊;金杭斌;;大鼠非酒精性脂肪性肝炎形成過程中腸道通透性的變化[J];中華消化雜志;2006年08期

6 徐衛(wèi)華,吳性江,黎介壽;門靜脈壓力改變對門靜脈高壓癥腸道通透性的影響[J];中華外科雜志;2002年03期

7 李寧,劉放南,李幼生,康健,李福建,黎介壽;腹部手術(shù)后患者血漿谷氨酰胺的變化及對腸道通透性的影響[J];腸外與腸內(nèi)營養(yǎng);1998年01期

8 吳建濃;朱美飛;雷澍;王靈聰;;電針對膿毒癥患者腸道通透性的影響[J];中國針灸;2013年03期

9 胡燕,陽文琳,黎海芪,陳國民,瞿平;采用高效液相色譜法檢測兒童腸道通透性的方法學(xué)研究[J];中國兒童保健雜志;2005年01期

10 葛姍姍;吳建濃;朱英;郭鑫艷;;不同方法治療后膿毒癥患者的腸道通透性測定及比較[J];中國中醫(yī)急癥;2012年11期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 金希;厲有名;虞朝輝;呂國才;徐磊;金杭斌;;大鼠非酒精性脂肪性肝炎形成過程中腸道通透性的變化[A];2007年浙江省消化系疾病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2007年

2 宇汝勝;汪昌榮;;燒傷后腸道通透性改變[A];第七屆全國燒傷創(chuàng)瘍學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2002年

3 吳煒烽;呂賓;方莉;張爍;;云母對大鼠實(shí)驗(yàn)性NSAIDs腸病腸道通透性的影響[A];第二屆浙江省消化病學(xué)術(shù)大會論文匯編[C];2009年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 曾小斌;益生菌對重癥急性胰腺炎腸道通透性改變的實(shí)驗(yàn)研究[D];四川醫(yī)科大學(xué);2015年

2 趙謙;小鼠急性心肌梗死后腸道通透性變化及谷氨酰胺對其影響的研究[D];華北理工大學(xué);2016年

3 雷一慧;乳凝集素改善壞死性小腸結(jié)腸炎腸道通透性及損傷修復(fù)的研究[D];上海交通大學(xué);2015年

4 樊春華;腸黏膜損傷與腸道通透性的關(guān)系及腸炎清對二者影響的研究[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2008年

5 陳丹;1. 腸道通透性HPLC-ELSD檢測方法研究 2. 經(jīng)大孔樹脂處理的中藥提取物中殘留溶劑分析方法研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2007年

6 朱疆依;尿L/M值與尿PEG600測定在評價(jià)腸道通透性上的比較研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2008年

  本文關(guān)鍵詞：乳凝集素改善壞死性小腸結(jié)腸炎腸道通透性及損傷修復(fù)的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：292778