發(fā)布時間：2020-11-13 03:30

　　 背景:先天性心臟病是兒童心外科手術(shù)中最主要的原因之一,發(fā)病率居高不下,近年來,發(fā)病率突破2‰,新生兒先心病的發(fā)病率高,約50%的危重患兒得不到及時治療于1歲以內(nèi)死亡,嚴(yán)重危害兒童的生命健康。越來越多復(fù)雜心血管疾病的患兒,經(jīng)心外科手術(shù)得以延長生命、減輕病痛[1,2]。隨著CPB(Cardiopulmonary Bypass,CPB)技術(shù)的不斷改進,CPB在冠脈旁路移植等高難度高復(fù)雜的心外科手術(shù)中,發(fā)揮了積極有益的作用,心外科重癥手術(shù)患者的手術(shù)死亡率明顯下降,同時,CPB技術(shù)顯著降低了重癥手術(shù)的術(shù)后并發(fā)癥,是心血管手術(shù)中不可替代的重要組成部分。CPB技術(shù)對心肌組織反復(fù)斷血再灌注的操作特點,使得其在輔助心血管外科手術(shù)的同時,引起了不同程度的心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion inury,MIRI),造成嚴(yán)重的心肌順應(yīng)性減低,甚至有些患者誘發(fā)心衰、惡性心律失常等嚴(yán)重兇險性并發(fā)癥的發(fā)生[2,3,4,5]。隨著臨床技術(shù)的更新,低溫心臟停搏液在臨床得以廣泛推廣和應(yīng)用,CPB后心肌組織缺血再灌注損傷的問題,得到了顯著的改善,然而,CPB后心肌順應(yīng)性降低、心臟收縮功能障礙引起的射血分?jǐn)?shù)降低等心功能受損現(xiàn)象,嚴(yán)重降低了手術(shù)療效,給患兒造成了嚴(yán)重影響。CPB后約7%的成人可出現(xiàn)缺血性透壁性心梗,約10%的成人出現(xiàn)左室收縮功能障礙[6,7]。兒童的心肌組織結(jié)構(gòu)與成熟心肌差別巨大,兒童心肌組織的肌原纖維發(fā)育不完全,心肌組織收縮能力較成年人差,未成熟心肌組織的室壁張力較成年人高,心臟的順應(yīng)性差,興奮性高,依賴糖酵解供能,能量利用率低,對應(yīng)激的適應(yīng)能力也不如成熟心肌。CPB手術(shù)的患兒再灌注后,心肌損傷程度較成人嚴(yán)重。由于臨床常用的心肌停搏液等心肌組織保護方法,其研發(fā)和設(shè)計主要針對成熟心肌,不適用于兒童心肌組織,未成熟心肌在能量產(chǎn)生利用及興奮耦聯(lián)等方面存在明顯的區(qū)別[8,9]。因此,針對小兒未成熟心肌的特點,我們迫切尋求一種緩解CPB后未成熟心肌損傷的方法,旨在減少患兒術(shù)后并發(fā)癥,切實增強手術(shù)療效。以G蛋白耦聯(lián)受體激酶2(G protein-coupled receptorkinase2,GRK2)為靶點的基因治療在動物模型和體外細(xì)胞實驗中均取得了許多成果,GRK2即β腎上腺素受體激酶 1(β-adrenergic receptor kinasel,βARK1),研究發(fā)現(xiàn),抑制GRK2的表達能提高缺血缺氧心肌組織β AR的密度和敏感性[10],能夠增強心肌組織的收縮能力,鑒于上述因素,其在心肌組織的缺血再灌注損傷中,發(fā)揮重要功效。β腎上腺素受體激酶抑制劑βARKct即GRK2阻斷劑,能夠通過調(diào)節(jié)心臟舒縮過程中相關(guān)蛋白和分子的表達[11],發(fā)揮保護心肌組織有效舒縮目的,在心肌組織缺血再灌注損傷中的研究前景廣闊。將βARKct轉(zhuǎn)染至人類心肌細(xì)胞能夠增強心肌收縮功能,βARKct水平與缺血缺氧后心功能改善程度正相關(guān)[12,13]。課題組前期實驗證實,以腺病毒為載體將βARKct轉(zhuǎn)染至CPB豬心肌組織中,能夠抑制GRK2的表達,增加βI-AR的密度,顯著增強成熟心肌的心功能。然而,作為異種蛋白,機體對腺病毒會不同程度地產(chǎn)生細(xì)胞免疫,進而對腺病毒裝載的基因治療產(chǎn)生抵抗[14]。腺病毒載體心肌局部組織高濃度的應(yīng)用,對注射部位心肌組織損傷嚴(yán)重,且腺病毒載體有潛在的致突變性[15],β ARKct對CPB后未成熟心肌組織的保護作用尚無報道。鑒于幼稚心肌的發(fā)育不全性,腺病毒對幼稚心肌組織局部損傷較成熟心肌更加嚴(yán)重,其潛在的致突變性對幼稚心肌的遠(yuǎn)期損傷不可估量;且作為生物載體,腺病毒制劑的儲存運輸方面的要求極為嚴(yán)格,臨床推廣有一定的局限性。我們試想,能否研發(fā)一種更加有效的藥物載體,利用其緩釋穩(wěn)定的特性,減輕局部高濃度腺病毒對心肌組織的毒副作用,在盡可能發(fā)揮藥物最大功效的同時,最大程度上降低藥物的毒副作用,從而優(yōu)化藥物的治療效應(yīng),同時,更加深入地探討βA RKct心肌保護作用的機制。納米脂質(zhì)體(Lipid nanoparticles,LNPs)是一種雙層的磷脂結(jié)構(gòu),能夠分別在其內(nèi)水相和雙層磷脂膜之間包封親水性和疏水性的藥物。脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)特殊,能夠裝載大量藥物,眾所周知,因為脂質(zhì)體的理化性質(zhì)比較穩(wěn)定,作為常用的藥物載體,其實驗室研究及臨床應(yīng)用已經(jīng)非常成熟[16,17]。然而,普通的脂質(zhì)體在體內(nèi)容易被清除,藥物的有效血藥濃度難以保障。對脂質(zhì)體的研究中心發(fā)現(xiàn),長循環(huán)納米脂質(zhì)體(Long Circulation Lipid nanoparticles,LC-LNPs),是一種經(jīng)特定聚合物修飾的,在機體免疫方面具有較低免疫原性的復(fù)合脂質(zhì)體,其載藥安全性已被廣泛研究,作為一種新型的藥物載體,長循環(huán)納米脂質(zhì)體有獨特的理化性質(zhì),特定聚合物與脂質(zhì)體結(jié)合,在脂質(zhì)體的表面,產(chǎn)生了一層特殊的化學(xué)性修飾保護膜,該保護膜為親水性,親水的特性,能夠延長脂質(zhì)體的體循環(huán)時程,降低血液清除率[17,18],其穩(wěn)定性、長效性、高效性在基因載體中優(yōu)越性明顯,有較高的生物相容性及靶向性,能夠切實保護所裝載藥物不被機體各種生物活性物質(zhì)代謝,具有緩釋、裝載效率高等明顯特征[19],是未來基因載體的重要研究方向。目的:1、研發(fā)長循環(huán)納米脂質(zhì)體復(fù)合物βARKct-CMD-LPNs,旨在避開生物載體的弊端,研發(fā)一種方便運輸儲藏的穩(wěn)定載體,在最大程度上發(fā)揮藥物生物學(xué)功效的情況下,盡量減少藥物的用藥量,盡最大努力減少目的藥物對機體的毒副作用,以提高藥物的藥效,優(yōu)化藥物。2、研究βARKct-CMD-LPNs對CPB后幼稚豬心肌組織的保護作用,初步探討其對幼稚心肌組織的保護作用作用機制。3、進行體外細(xì)胞培養(yǎng),模仿體內(nèi)心肌缺血缺氧的過程,通過多層面,多角度更加深入地探討βARKct-CMD-LPNs對缺氧再復(fù)氧后大鼠心肌細(xì)胞具體保護作用及其作用機制。方法:首先構(gòu)建普通脂質(zhì)體,利用化學(xué)方法對構(gòu)建的脂質(zhì)體進行修飾,使其理化性質(zhì)更加優(yōu)越,利用先進的納米技術(shù),構(gòu)建長循環(huán),具有靶向載藥功能的納米脂質(zhì)體復(fù)合物βARKct-CMD-LPNs。針對CPB后MIRI錯綜復(fù)雜的機制,構(gòu)建豬體外循環(huán)CPB模型,觀察納米脂質(zhì)體復(fù)合物βARKct-CMD-LPNs對CPB后未成熟豬血流動力學(xué)和心臟形態(tài)及功能方面的改善作用;通過CPB后血液指標(biāo)及對心肌組織的實驗室檢查,初步分析βARKct-CMD-LPNs對CPB后幼稚豬心肌保護作用的原理。構(gòu)建大鼠H9C2心肌細(xì)胞缺氧再復(fù)氧模型,通過體外細(xì)胞實驗,進一步評價復(fù)合物βARKct-CMD-LPNs對大鼠H9C2心肌細(xì)胞的體外保護作用,同時,利用westernblot法對多種蛋白進行檢測,將多條信號傳導(dǎo)通路進行并行檢測評估,多途徑進一步深入分析,心肌組織缺血再灌注損傷的關(guān)鍵通路和損傷后的治療靶點,以期為實現(xiàn)βARKct-CMD-LPNs從細(xì)胞水平分子機制到大動物模型的轉(zhuǎn)化提供重要的事實依據(jù)和理論支撐。1、構(gòu)建CMD-LPNs長循環(huán)納米脂質(zhì)體載體,通過將納米技術(shù)與基因轉(zhuǎn)染技術(shù)銜接,利用薄膜透析法,將聚合物葡聚糖與油胺發(fā)生化學(xué)反應(yīng),修飾到普通脂質(zhì)體上,裝載目的基因,合成具有特殊理化性質(zhì)的βARKct-CMD-LPNs納米脂質(zhì)體復(fù)合物。用紅外光譜、核磁共振、粒徑大小及分布、Zeta電電位、透射電鏡等方法對上述研發(fā)物進行表征,對其生物利用性能進行評估,成功研發(fā)出長循環(huán)納米脂質(zhì)體復(fù)合載體,更有利于目的基因的裝載,在達到最大可能發(fā)揮藥物生物學(xué)功效的同時,盡最大程度上減少目的藥物的毒副作用,提高藥物的藥效。2、構(gòu)建幼稚豬CPB模型,通過βARKct-CMD-LPNs處理,觀察ARKct-CMD-LPNs對CPB后豬血流動力學(xué)和心臟形態(tài)及功能方面的改善作用,確認(rèn)βARKct-CMD-LPNs對CPB后豬心臟的保護作用;通過βARKct-CMD-LPNs處理,分析CPB后豬血液及組織學(xué)指標(biāo),研究豬體內(nèi)激素水平、心肌損傷程度、受體水平、能量通路的保護和改善作用;用RT-PCR和Western blot法在基因水平和蛋白水平共同探討β AR的表達情況;評估βARKct-CMD-LPNs在凋亡通路、炎性通路、能量通路等方面的作用。3、按照要求,制作大鼠H9C2心肌細(xì)胞缺氧再復(fù)氧模型,造模成功后,利用Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞法,檢測心肌細(xì)胞凋亡率;Elisa法測LDH、TNF-α、IL-1、MDA、ROS、SOD等炎性因子及活性氧族的濃度,評估心肌細(xì)胞缺氧再復(fù)氧后的損傷程度,同時,評價各組心肌細(xì)胞脂質(zhì)過氧化程度,研究各組心肌細(xì)胞清除氧自由基的能力;Western blot法評估凋亡相關(guān)蛋白β-Foxo1/Casβase3,自噬相關(guān)蛋白Foxo 1/LC的表達情況;評估GRK2、β-Foxo 1/Foxo 1蛋白表達量的關(guān)系。數(shù)據(jù)統(tǒng)計,綜合分析,評估βARKct-CMD-LPNs對心肌組織細(xì)胞的保護作用及機制。通過對多種信號通路的分析,進一步明確βARKct-CMD-LPNs的保護機制,為實現(xiàn)βARKct-CMD-LPNs從細(xì)胞水平分子機制到大動物模型的轉(zhuǎn)化提供重要的事實依據(jù)和理論支撐。結(jié)果:1、紅外光譜、核磁共振、粒徑電位、透射電鏡等方法對βARKct-CMD-LPNs納米脂質(zhì)體復(fù)合物表征后發(fā)現(xiàn),新構(gòu)建的復(fù)合物理化性質(zhì)明確,其紅外吸收光譜在1680-1750cm處,可發(fā)現(xiàn)C=O特異性吸收波峰,我們推斷,葡聚糖完成了羧基化反應(yīng)。其電位約-20mV,CMD各分子層之間電負(fù)性,適度的靜電排斥以及空間位阻效應(yīng),保證該復(fù)合物之間不易聚集,具有良好的物理穩(wěn)定性。脂質(zhì)體的粒徑比較均一,呈正態(tài)分布趨勢,大約在90nm左右,合成的脂質(zhì)體測包封率基本能夠大于90%,滿足藥典的基本要求。該復(fù)合物于低溫冰箱中長期儲存后發(fā)現(xiàn)其粒徑及電位基本保持不變,且該復(fù)合物在血清中具備良好的穩(wěn)定性。通過上述結(jié)果分析,我們認(rèn)為所研發(fā)的βARKct-CMD-LPNs復(fù)合物成功,達到藥典的要求。2、βARKct-CMD-LPNs復(fù)合物對CPB后豬心功能有保護作用。實驗證實:βARKct-CMD-LPNs復(fù)合物預(yù)防性應(yīng)用能夠增加CPB后幼稚豬左室射血分?jǐn)?shù)、左室容積,心功能的多項指標(biāo)得到了顯著改善。同時,βARKct-CMD-LPNs復(fù)合物預(yù)防性應(yīng)用能夠調(diào)控CPB后多項激素的分泌情況,維持能量代謝通路,增加β受體的密度和反應(yīng)性,保護心肌組織,同時,能夠減少凋亡的發(fā)生,保護心肌組織。H-E染色、電鏡實驗結(jié)果證實CPB后豬心肌組織及細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生了嚴(yán)重的損傷,大量心肌細(xì)胞凋亡;實驗證明,通過預(yù)防性應(yīng)用βARKct-CMD-LPNs復(fù)合物,CPB后豬心肌細(xì)胞的損傷情況明顯緩解,凋亡細(xì)胞數(shù)量減少,心肌組織得到了切實有效的保護。免疫熒光染色、Western blot及RT-PCR法證實:CPB后血液中去甲腎上腺素分泌增加,豬心肌組織β1-AR、β2-AR數(shù)量減少,SERCA2a/RYR2表達減少,GRK2表達顯著增加,βARKct-CMD-LPNs復(fù)合物預(yù)防性應(yīng)用,血液中去甲腎上腺素分泌略降低,豬心肌組織β1-AR數(shù)量恢復(fù),SERCA2a/RYR2表達增加,GRK2表達略下降。3、體外H9C2心肌細(xì)胞培養(yǎng)后,證明脂質(zhì)體復(fù)合物的心肌保護作用,結(jié)果顯示,缺氧再復(fù)氧后,損傷加重,心肌細(xì)胞炎性細(xì)胞因子的分泌較正常明顯增多,心肌細(xì)胞損傷嚴(yán)重,βARKct-CMD-LPNs組心肌細(xì)胞炎性因子分泌少,心肌細(xì)胞損傷程度較輕。Western blot證明,缺血缺氧復(fù)氧組載體對照組、缺血缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡指標(biāo)Caspase3、p-Foxo 1表達明顯增加,βARKct-CMD-LPNs組Caspase3、p-Foxo1的表達較上述兩組下調(diào)。與正常對照組相比,缺血缺氧復(fù)氧組載體對照組、缺血缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞自噬相關(guān)指標(biāo)LC3-I1、Foxo1表達明顯增加,βARKct-CMD-LPNs組LC3-Ⅱ、Foxo 1的表達較上述兩組下調(diào)。結(jié)論:1、βARKct-CMD-LPNs納米脂質(zhì)體復(fù)合物的良好理化性質(zhì)及血清穩(wěn)定性的特征,有利于目的基因的裝載,在達到最大可能發(fā)揮藥物生物學(xué)功效的同時,盡可能降低藥物的毒性作用,從而優(yōu)化藥物的治療效應(yīng)。該復(fù)合物的研發(fā)成功,為藥物的裝載提供了基因脂質(zhì)體聯(lián)合的新穎思路,其臨床應(yīng)用前景廣闊。2、βARKct-CMD-LPNs預(yù)防性應(yīng)用,可顯著改善CPB后幼稚豬心臟功能各項指標(biāo),切實提高了心肌組織的舒縮功能,降低了過度凋亡的發(fā)生,對幼稚心肌細(xì)胞線粒體的形態(tài)和功能保護作用效果顯著,同時,提高β1-AR的密度和敏感性,從而實現(xiàn)保護心肌組織的作用。3、實驗證實,βARKct-CMD-LPNs復(fù)合物預(yù)防性應(yīng)用,對大鼠源性H9C2心肌細(xì)胞缺氧再復(fù)氧模型的保護作用明顯,多種實驗結(jié)果證實,該復(fù)合物的心肌保護作用,通過多種信號通路發(fā)揮對幼稚心肌的保護作用。Foxo1對GRK2的轉(zhuǎn)錄有正向調(diào)控作用,βARKct-CMD-LPNs復(fù)合物可能通該調(diào)控作用發(fā)揮心肌細(xì)胞的保護功效。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R726.5
【部分圖文】：

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Ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ?ＣＭＤ??圖ｌ－ｌ相關(guān)化學(xué)結(jié)構(gòu)簡式??圖１－１?Ａ：磷脂結(jié)構(gòu)簡式Ｂ：膽固醇結(jié)構(gòu)簡式Ｃ：兩親性ＣＭＤ合成化學(xué)反應(yīng)式??，ｙｊ??．?１??ｙｂｅ＾．．??圖１－２產(chǎn)物展示??圖１－２八：白色絮狀產(chǎn)物０＾１０；８：自左至右依次為？８５、藍(lán)色混懸液０＾０－１＾階、??ｐＡＲＫｃｔ－ＣＭＤ－ＬＰＮｓ。??２９??

圖１－４?ＣＭＤ－ＬＰＮｓ粒徑分布??
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本文編號：2881660