病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是兒科臨床常見(jiàn)的心血管系統(tǒng)疾病之一，其臨床表現(xiàn)各異，在急性期，輕者可以沒(méi)有癥狀，重者可發(fā)生心力衰竭、心源性休克、室性快速性心律失常，甚至猝死，部分遷延不愈者會(huì)最終演變成擴(kuò)張性心肌病，嚴(yán)重威脅身體健康。二十世紀(jì)七十年代以來(lái)，VMC的發(fā)病日趨增多，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者以柯薩奇B組病毒(Coxsackieviruses group B，CVB)建立了VMC的動(dòng)物模型或細(xì)胞模型，從免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等方面探討VMC的發(fā)病機(jī)制，但其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，故研究其發(fā)病機(jī)理，為臨床治療提供理論依據(jù)是當(dāng)前心血管科研工作者研究的熱點(diǎn)。 VMC的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，目前比較明確的是病毒對(duì)心肌細(xì)胞的直接損傷作用和機(jī)體感染病毒后所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)對(duì)心肌細(xì)胞的殺傷作用。但其確切的機(jī)制尚未完全闡明。有研究表明病毒對(duì)心肌細(xì)胞離子通道的作用可能參與和／或加重病毒對(duì)心肌細(xì)胞的損傷。鉀離子通道在所有離子通道中占據(jù)重要地位，它在遺傳上或功能上都具有多樣性，在維持膜靜息電位，膜興奮性以及膜復(fù)極化速率等方面起著關(guān)鍵性的作用，已成為心血管疾病醫(yī)學(xué)研究的熱門(mén)課題和醫(yī)藥發(fā)展的主攻方向。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究表明，在心肌梗塞后、高血壓性肥大心肌及慢性心力衰竭或慢性心律失常等成人多見(jiàn)疾病中鉀離子通道基因的mRNA水平發(fā)生了改變，但對(duì)其在病毒性心肌炎中的改變尚未見(jiàn)報(bào)道。 浙三工大學(xué)博士學(xué)位論文 尋找治療VMC的有效藥物一直是臨床工作人員和科研工作者的關(guān)注點(diǎn)。國(guó) 內(nèi)研究表明，多種中草藥在病毒性心肌炎的治療中取得較好的效果，特別對(duì)心肌 炎的慢性階段有良好的療效。近年來(lái)的研究表明:蘆丁可明顯抑制胞膜脂質(zhì)氧化 酶，有效地保護(hù)心肌細(xì)胞膜的完整性，從而對(duì)缺糖缺氧和缺血后再灌注損傷的心 肌細(xì)胞有良好的保護(hù)作用。但迄今尚未見(jiàn)有關(guān)蘆丁是否對(duì)病毒感染的心肌細(xì)胞有 保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)理的報(bào)道。 本研究選用體外培養(yǎng)的新生SD大鼠心肌細(xì)胞，建立嗜心性CVB(my。carditiC CvB3，CvBam)感染心肌細(xì)胞的模型，觀察病毒感染后心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化、 培養(yǎng)上清中鉀離子濃度改變及心肌細(xì)胞膜上電壓門(mén)控鉀離子通道Kvl .2、Kvl .5、 Kv2.1、Kv4.2基因的mRNA水平和Kvl.5、Kv4.2蛋白水平的改變，以蘆丁千預(yù) 后，觀察這些指標(biāo)的相應(yīng)改變，從離子通道的角度來(lái)探討VMC的發(fā)病機(jī)理、心律 失常發(fā)生機(jī)制和蘆丁的作用機(jī)制。 第一部分SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)、 病毒性心肌炎模型的建立 用分步胰酶消化法獲取SD大鼠乳鼠的心肌細(xì)胞，采用差速貼壁法和BrdU 抑制法提純心肌細(xì)胞。在心肌細(xì)胞培養(yǎng)滿(mǎn)48小時(shí)后，隨機(jī)把細(xì)胞分成二組:正 常對(duì)照組和病毒感染組。在病毒感染組中添加含ZooTeIDS。CVB3。的RpMll640培 養(yǎng)基，對(duì)照組僅加培養(yǎng)基，37℃溫育2小時(shí)后，各組棄上清，以Hank’S液沖洗 后加培養(yǎng)基，置37℃培養(yǎng)觀察，每2一3天換液，觀察心肌細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，并 分別在病毒感染后24小時(shí)、72小時(shí)、120小時(shí)抽取上清送檢心肌酶AST、LDH、 CK一MB。 結(jié)果 1.倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)、搏動(dòng)的觀察:孵育24小時(shí)時(shí)乳鼠心肌細(xì)胞均已 貼壁，呈梭形，有少量分叉，折光性強(qiáng)，細(xì)胞之間沒(méi)有完全融合，細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn) 緩慢小幅搏動(dòng)，孵育48小時(shí)后心肌細(xì)胞折光性更強(qiáng)，分叉增多，融合成團(tuán)，呈 菊花狀，100%心肌細(xì)胞以40~120次/分鐘的頻率搏動(dòng)，同團(tuán)細(xì)胞為同步搏動(dòng)， 浙會(huì)工大學(xué)博士學(xué)位論文 非同團(tuán)細(xì)胞絕大多數(shù)為同步搏動(dòng)，有個(gè)別為非同步搏動(dòng)。病毒感染后48小時(shí)內(nèi) 心肌細(xì)胞的外形無(wú)明顯改變，但搏動(dòng)頻率有所下降，并出現(xiàn)非同步搏動(dòng)增多，至 72小時(shí)后，感染細(xì)胞搏動(dòng)明顯減少甚至停止搏動(dòng)，出現(xiàn)病變細(xì)胞:折光性下降， 細(xì)胞變圓，變暗，成團(tuán)，破壞，可發(fā)現(xiàn)影子細(xì)胞(ghos七cen)(細(xì)胞體積明顯 增大，內(nèi)容物減少，細(xì)胞核未見(jiàn))，CPE在(+)~(+++)之間，至120小時(shí)， 非感染細(xì)胞仍同步搏動(dòng)，而感染細(xì)胞幾乎全部停止搏動(dòng)，細(xì)胞灰暗，成團(tuán)，細(xì)胞 間隙增寬，培養(yǎng)上清中漂浮物增多。 2.病毒感染后細(xì)胞培養(yǎng)上清中心肌酶AST、LDH、CK一MB的變化:病毒感染 24小時(shí)，培養(yǎng)上清中心肌酶AST、LDH、CK一MB水平在對(duì)照組與感染組之間均沒(méi) 有顯著性差異(P0.05)，在72小時(shí)、120小時(shí)，感染組的心肌酶AST、LDH、CK一MB 水平均升高，與對(duì)照組比較有顯著(P0.05)或極顯著差異(Pq.01)o各組在 72小時(shí)、120小時(shí)時(shí)間點(diǎn)與本組24小時(shí)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行配對(duì)T檢驗(yàn)，對(duì)照組心肌酶 AST、CK一MB沒(méi)有顯著改變(P)0.05)，LDH有極顯著降低(P(0.01);感染組各心 肌酶則均有極顯著升高(P0.01)。 第二部分培養(yǎng)心肌細(xì)胞感染病毒后電壓門(mén)控鉀離子通道表達(dá)的改變 同第一部分培養(yǎng)心肌細(xì)胞和建立心肌細(xì)胞病毒感染模型后，在病毒感染24 小時(shí)、72小時(shí)、120小時(shí)點(diǎn)各抽取培養(yǎng)上清lml送檢上清中K+，在120小時(shí)點(diǎn) 終止細(xì)胞培養(yǎng)，抽取細(xì)胞的總RNA和細(xì)胞膜總蛋白，分別用RT一PcR和Western blotting法鋇(定心肌細(xì)胞的電壓門(mén)控鉀離子通道Kvl.2、Kvl.5、Kv2.1、Kv4.2的 mRNA和Kvl.5、Kv4.2的蛋白水平。 結(jié)果 1.病毒感染后培養(yǎng)上清中I{+的變化:病毒感染組在病
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類(lèi)】：R725.4
【部分圖文】：

RT-PCR法測(cè)定鉀浦遣&v1.2,Rv1.5;%v2.1,%v4.2的.味目石水平兒naxkerC:對(duì)照組I:感染組

ITKVZ.l圖3一122、K節(jié)1。5、:感染組KVZ.1、KV4。2K誠(chéng).枷F】萬(wàn)A的影響T:千預(yù)組巧kD，呻吟味份州甲扮一神呼護(hù)甲C1TC1TCIT圖3一14蘆丁對(duì)心肌細(xì)胞鉀離子通道Kvl.5蛋白的影響c:對(duì)照組工:感染組T:治療組7。勺.甘勸目皿可卜匆臺(tái)，.口CITCIT圖3一巧蘆丁對(duì)心肌細(xì)胞鉀離子通道Kv生.2蛋白的影響C:對(duì)照組工:感染組T:治療組

—口一a心七丘nTCIT.2Kvl.5丁對(duì)心肌細(xì)胞鉀離子通道Kvl.爪，麗arkerC:對(duì)照組工ITKVZ.l2、K節(jié)1。5、:感染組KVZ.1、KV4。2K誠(chéng).枷F】萬(wàn)A的影響T:千預(yù)組呻吟味份州甲扮一神呼護(hù)甲1TC1TCIT3一14蘆丁對(duì)心肌細(xì)胞鉀離子通道Kvl.5蛋白的影響c:對(duì)照組工:感染組T:治療組勺.甘勸目皿可卜匆臺(tái)，.口CITCIT3一巧蘆丁對(duì)心肌細(xì)胞鉀離子通道Kv生.2蛋白的影響C:工:T:
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