發(fā)布時(shí)間：2020-11-09 22:06

　　 第一部分早產(chǎn)兒生后經(jīng)驗(yàn)性抗生素使用對(duì)早期腸道菌群及代謝產(chǎn)物的影響目的:新生兒時(shí)期是腸道菌群穩(wěn)態(tài)建立的關(guān)鍵時(shí)期,為了控制早發(fā)敗血癥,有感染高危風(fēng)險(xiǎn)的早產(chǎn)兒常常在生后立即經(jīng)驗(yàn)性使用抗生素,而抗生素對(duì)腸道菌群組成有顯著的影響。本研究旨在明確生后一周抗生素的使用對(duì)早產(chǎn)兒腸道菌群及其代謝產(chǎn)物的影響,為臨床抗生素的合理使用提供理論依據(jù)。方法:研究對(duì)象為出生后立即送往重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院住院治療的早產(chǎn)兒。依據(jù)抗生素使用情況分為兩組,一組為哌拉西林他唑巴坦鈉組(Piperacillin/tazobactam,Pt組),另一組為聯(lián)用青霉素與拉氧頭孢組(Penicillin+Latamoxef,PL組),對(duì)照組為未用抗生素組(Antibiotic-free,AF組)。分別收集三組患兒第3天(Day3)和第7天(Day7)的糞便標(biāo)本,基于16S r DNA高通量測(cè)序的方法分析各組患兒腸道菌群組成情況,采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用平臺(tái)對(duì)三組患兒腸道代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析。結(jié)果:與日齡第3天相比,哌拉西林他唑巴坦鈉(Pt)組與青霉素拉氧頭孢聯(lián)用(PL)組第7天的物種多樣性指數(shù)Shannon index降低(Pt組P0.05,PL組P0.01),而未用抗生素(AF)組第3天和第7天的Shannon指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)結(jié)果表明在日齡第3天和第7天抗生素組組內(nèi)標(biāo)本個(gè)體差異均較對(duì)照組大;菌群組成分析結(jié)果顯示,在門(mén)水平,日齡第3天三組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的菌群為擬桿菌門(mén)(P0.001)和放線菌門(mén)(P0.05),當(dāng)抗生素連續(xù)使用7天后,三組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的菌群為變形菌門(mén)(P0.05)、厚壁菌門(mén)(P0.05)、擬桿菌門(mén)(P0.001)、放線菌門(mén)(P0.01),將各組自身第3天和第7天的菌門(mén)比例變化進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),僅Pt組的放線菌門(mén)和PL組的擬桿菌門(mén)變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,Pt組的放線菌門(mén)比例在第7天較第3天降低(P0.01),而PL組的擬桿菌門(mén)比例第7天較第3天增加(P0.01);在屬水平,假單胞菌屬(占Pt組23.73%為三組中最高,P0.05),腸球菌屬(占Pt組23.26%為三組中最高,P0.01),乳桿菌屬(占PL組28.04%為三組中最高,P0.001),鞘氨醇單胞菌屬(占PL組6.64%為三組中最高,P0.001)在三組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,在第7天三組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的菌屬為克雷伯菌屬(占AF組64.39%為三組中最高,P0.05),腸球菌屬(占Pt組48.12%為三組中最高,P0.001),埃希-志賀菌屬(占PL組17.25%為三組中最高,P0.05),狹義梭菌屬(占AF組5.62%為三組中最高,P0.01),Peptoclostridium菌屬(占AF組5.60%為三組中最高,P0.001),假單胞菌屬(占PL組2.688%為三組中最高,P0.01),比較各組自身第3天和第7天的菌屬比例發(fā)現(xiàn),Pt組中腸球菌在抗生素使用7天后比例升高(P0.05),而埃希-志賀菌屬(P0.05)、假單胞菌屬及不動(dòng)桿菌屬(P均0.001)比例降低,PL組中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的菌屬為乳桿菌屬(P0.01)、鞘氨醇單胞菌屬及不動(dòng)桿菌屬(P均0.05),均在第7天比例下降,而AF組中克雷伯菌屬在第7天比例顯著升高(P0.05),不動(dòng)桿菌屬(P0.001)及埃希-志賀菌屬(P0.05)比例降低;分析代謝組學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)第3天三組間有差異的代謝產(chǎn)物為絲氨酸、纈氨酸、丙三醇、葡萄糖酸(P均0.05)及脯氨酸(P0.01),第7天有6種代謝產(chǎn)物有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,具體為檸檬酸、纈氨酸(P均0.001)、亞油酸、谷氨酸(P均0.01)、以及酪氨酸和泛酸(P均0.05);差異代謝通路分析顯示第3天時(shí)三組間僅有7條代謝通路有顯著差異(P均0.05),其中Pt組與PL組代謝通路的活性完全相反,在第7天則有22條代謝通路出現(xiàn)了明顯差異(P均0.05),其中PL組與AF組的代謝通路活性完全相反;PLS-DA分析顯示隨抗生素使用時(shí)間延長(zhǎng)抗生素組腸道代謝產(chǎn)物的構(gòu)成與未用抗生素組差異增大,且在不同的抗生素種類(lèi)作用下代謝產(chǎn)物的構(gòu)成也明顯不同;菌群與代謝產(chǎn)物的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)亞油酸、谷氨酸、纈氨酸、泛酸等人體重要的代謝產(chǎn)物在AF組都顯著增加,且與該組中菌群豐度豐富的韋榮球菌屬,檸檬酸桿菌屬及Peptoclostridium菌屬密切相關(guān),但與兩抗生素組中豐度高的菌群呈明顯的負(fù)相關(guān),特別是青霉素拉氧頭孢聯(lián)用組。結(jié)論:抗生素對(duì)早產(chǎn)兒生后一周腸道菌群的定植及代謝產(chǎn)物產(chǎn)生了顯著的影響。隨抗生素使用時(shí)間延長(zhǎng),抗生素組致病菌的比例明顯增多,如埃希-志賀菌屬及腸球菌屬。此外無(wú)論抗生素的種類(lèi),7天時(shí)抗生素組菌群的多樣性較第3天顯著下降。而腸道代謝產(chǎn)物及相關(guān)代謝通路的變化趨勢(shì)也與高通量測(cè)序分析結(jié)果一致,隨抗生素使用時(shí)間延長(zhǎng)組間差異代謝產(chǎn)物和差異代謝通路都增加,每組中高表達(dá)的代謝產(chǎn)物多數(shù)與該組高豐度的菌群呈正相關(guān),抗生素組正常代謝產(chǎn)物表達(dá)減少,重要代謝通路活性降低,而青霉素與拉氧頭孢聯(lián)用對(duì)腸道菌群與代謝產(chǎn)物的影響明顯大于哌拉西林他唑巴坦鈉。第二部分維生素A在新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎中的作用研究目的:新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎(Neonatal necrotizing enterocolitis,NEC)是發(fā)生在新生兒尤其是早產(chǎn)兒的嚴(yán)重腸道急癥。目前普遍認(rèn)為NEC是由于病原菌入侵發(fā)育未成熟的腸上皮而引起的過(guò)度炎癥反應(yīng)。而維生素A(VA)是正常生理代謝必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),在上皮生長(zhǎng)、機(jī)體免疫調(diào)節(jié)等方面有重要的作用。故本研究擬通過(guò)檢測(cè)NEC發(fā)生時(shí)患兒腸道菌群及維生素A水平的變化情況,明確VA、菌群、NEC之間的相關(guān)性,再以補(bǔ)充VA為干預(yù)手段,研究其在NEC發(fā)生發(fā)展中的重要作用,為臨床治療提供新的思路。方法:臨床標(biāo)本收集及處理:收集重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院NEC手術(shù)患兒及對(duì)照腸閉鎖、腸狹窄患兒的血清及腸灌洗液標(biāo)本。采用高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)兩組患兒血清維生素A水平,基于16S r DNA高通量測(cè)序方法分析兩組患兒腸道菌群組成情況。體內(nèi)試驗(yàn):用VA(VAS組)及磷酸鹽緩沖液(PBS組)分別灌胃新生小鼠7天后進(jìn)行NEC建模,采用HPLC方法檢測(cè)兩組小鼠血清VA水平,采用HE染色、NEC病理評(píng)分比較兩組小鼠腸組織病理?yè)p傷情況;采用16S r DNA高通量測(cè)序的方法分析兩組新生鼠腸道菌群的組成情況;采用q PCR及ELISA檢測(cè)炎癥因子水平;采用蛋白質(zhì)印跡法(WB)比較兩組腸道緊密連接蛋白的表達(dá)情況。體外試驗(yàn):采用視黃酸(RA)干預(yù)人克隆結(jié)腸腺癌細(xì)胞(Caco-2 cell)形成的單層腸上皮細(xì)胞屏障模型,測(cè)定跨上皮電阻TEER值分析單層腸上皮細(xì)胞的完整性;采用q PCR及ELISA分析RA干預(yù)后Caco-2細(xì)胞分泌炎癥因子水平;采用WB分析RA干預(yù)后腸道緊密連接蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:臨床標(biāo)本:NEC組患兒血清VA水平明顯低于對(duì)照組(P0.05),腸道變形菌門(mén)比例較對(duì)照組升高(P0.05),擬桿菌門(mén)比例降低(P0.01)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn):VAS組的VA水平明顯高于PBS組(P0.01),門(mén)水平變形菌門(mén)比例較PBS組降低(P0.05),擬桿菌門(mén)增高(P0.01),屬水平埃希-志賀菌屬降低(P0.05)、擬桿菌屬增高(P0.01);q PCR及ELISA結(jié)果顯示炎癥因子IL-6、TNF-α表達(dá)下降(m RNA水平IL-6:P0.05,TNF-α:P0.01;蛋白水平IL-6:P0.001,TNF-α:P0.05),NEC組織病理學(xué)評(píng)分VAS組低于PBS組(P0.05),腸組織損傷減輕,腸道緊密連接蛋白Claudin-1,Occludin(P均0.05)及ZO-1(P0.01)表達(dá)水平增高。體外實(shí)驗(yàn):不同濃度RA干預(yù)后Caco-2細(xì)胞TEER明顯增加(P均0.01),能降低LPS對(duì)細(xì)胞的損傷;炎癥因子IL-6、IL-8表達(dá)均降低(m RNA水平IL-6:P均0.001,IL-8:5R-10L組P0.0001,2R-10L組P0.001;蛋白水平5R-10L組IL-6與IL-8:P均0.01,2R-10L組IL-6與IL-8:P均0.05);5R-10L組腸道緊密連接蛋白Occludin(P0.05)、Claudin-1及ZO-1(P均0.01)在RA干預(yù)后表達(dá)升高,而2R-10L組僅Claudin-1在RA干預(yù)后表達(dá)升高(P0.05),其余兩種蛋白表達(dá)與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論:NEC發(fā)病的部分機(jī)制可能為NEC患兒VA水平低,腸上皮細(xì)胞屏障發(fā)育不完善,變形菌門(mén)增加,擬桿菌門(mén)降低,腸道菌群穩(wěn)態(tài)發(fā)生紊亂,最終導(dǎo)致腸道屏障破壞,致病菌侵入腸粘膜引起過(guò)度炎癥反應(yīng)。補(bǔ)充VA可降低變形菌門(mén)比例、增加擬桿菌門(mén)比例,下調(diào)炎癥因子IL-6、IL-8、TNF-α水平,還可增強(qiáng)腸緊密連接蛋白的表達(dá)、提高腸上皮完整性,VA在NEC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的保護(hù)作用。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R722.6
【文章目錄】：
英漢縮略語(yǔ)名詞對(duì)照
中文摘要
英文摘要
前言
第一部分 早產(chǎn)兒生后經(jīng)驗(yàn)性抗生素使用對(duì)早期腸道菌群與代謝產(chǎn)物的影響
    1 研究對(duì)象與方法
    2 結(jié)果
    3 討論
    4 結(jié)論
第二部分 維生素A在新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎中的作用研究
    第一節(jié) 新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎患兒腸道菌群組成及維生素A水平研究
        1 研究對(duì)象與方法
        2 結(jié)果
        3 討論
        4 結(jié)論
    第二節(jié) 維生素A在新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎中的調(diào)節(jié)作用研究
        1 材料與方法
        2 結(jié)果
        3 討論
        4 結(jié)論
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
文獻(xiàn)綜述
    參考文獻(xiàn)
致謝
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