第一部分自閉癥譜系障礙兒童的腸道菌群變化及相關研究引言:自閉癥譜系障礙(autism spectrum disorder,ASD)是一組神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病,核心癥狀為社會交往、語言溝通障礙以及重復或受限的行為、興趣或活動。胃腸道癥狀(包括便秘、腹瀉和胃腸脹氣等)是ASD患者常見的伴隨癥狀。ASD病因尚不明確,目前普遍認為遺傳和環(huán)境因素均與其發(fā)病有關。大量研究表明,腸道菌群及其代謝產(chǎn)物(特別是短鏈脂肪酸,SCFAs)在ASD的發(fā)病機制中起著重要作用。然而,關于ASD兒童糞便短鏈脂肪酸的報道尚無一致結論;ASD兒童腸道菌群的結構及其與ASD兒童的行為癥狀、糞便SCFAs和胃腸道癥狀的關系仍未揭曉。目的:探索ASD兒童腸道菌群結構及其與糞便短鏈脂肪酸、行為癥狀嚴重程度和胃腸道癥狀之間的關系。材料與方法:1.分別納入30名ASD兒童,20名健康對照兒童。2.應用改進的六項胃腸道嚴重程度指數(shù)問卷評估兩組兒童的胃腸道癥狀。3.依據(jù)自閉癥治療評估表對ASD組兒童行為癥狀的嚴重程度進行評分。4.HPLC檢測兩組兒童糞便短鏈脂肪酸的含量。5.對兩組兒童糞便細菌16S r RNA基因的V3-V4高變區(qū)進行測序,并分析其菌群組成及結構差異。6.應用Spearman相關系數(shù)分析腸道菌群與短鏈脂肪酸的相關性。7.應用Spearman相關系數(shù)分析腸道菌群與ASD組兒童行為癥狀嚴重程度的相關性。8.分析與ASD組兒童伴隨胃腸道癥狀相關的菌群。結果:1.ASD組兒童與對照組兒童在年齡和性別上無統(tǒng)計學差異。2.ASD組兒童的便秘發(fā)生率顯著高于對照組(P0.05)。兩組兒童在腹瀉,腹痛,糞便性狀,糞便氣味,胃腸脹氣和胃腸道癥狀總評分上沒有顯著差異(P0.05)。3.ASD組兒童行為癥狀的評分分別為:語言(18.14±3.73),社交(27.83±3.84),感覺知覺(22.97±4.49)和健康/身體/行為(31.45±6.10)。4.與對照組兒童相比,ASD組兒童糞便中乙酸和丁酸含量降低,戊酸含量增高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。5.ASD組兒童與對照組兒童腸道菌群結構與分布存在顯著差異。與對照組兒童相比,ASD組兒童腸道菌群多樣性和均勻度顯著降低(P0.05)。在門水平,ASD組兒童糞便厚壁菌門比例較對照組顯著降低,而酸桿菌門比例較對照組顯著增高。在屬水平,應用LEfSe分析兩組兒童菌群各成分的豐度差異并篩選優(yōu)勢菌群,發(fā)現(xiàn)ASD組兒童糞便的優(yōu)勢菌群為Megamonas,Pseudomonas,Enterococcus和Acidobacteria等;而對照組兒童的優(yōu)勢菌群為Eubacterium,Peptostreptococcaceae,Streptococcaceae,Ruminococcaceae和Lachnospiraceae_NC2004_group等。6.Acidobacteria和Actinomycetaceae與糞便中戊酸水平呈正相關;Streptococcaceae,Peptostreptococcaceae,Lactobacillaceae和Clostridiaceae_1(ASD組兒童比例降低的菌群)與糞便中丁酸含量呈正相關。7.Megamonas與ASD組兒童健康/身體/行為評分和語言評分呈正相關(P0.05);Holdemanella與ASD組兒童感覺知覺評分呈正相關(P0.05)。8.便秘ASD組兒童較非便秘ASD組及對照組兒童糞便中Fusobacterium、Barnesiella、Coprobacter及戊酸正相關細菌(Actinomycetaceae)比例顯著增高,產(chǎn)丁酸菌群比例顯著降低。結論:便秘是本研究納入的ASD組兒童伴隨的唯一胃腸道癥狀。ASD組兒童糞便中乙酸和丁酸含量降低,戊酸含量增高。ASD組兒童與對照組兒童腸道菌群結構與分布存在顯著差異,具體來說,ASD組兒童產(chǎn)丁酸菌群比例降低,戊酸正相關菌群比例升高。且ASD組兒童腸道菌群與行為癥狀的嚴重程度相關。ASD及其伴隨便秘癥狀的發(fā)展可能與腸道內(nèi)產(chǎn)丁酸菌群比例降低和產(chǎn)戊酸菌群比例增加相關。第二部分兩種自閉癥譜系障礙模型小鼠腸道菌群及腸道屏障功能的改變目的:探討利用ASD的行為特征進行不同類型的小鼠建模時,是否會出現(xiàn)腸道菌群、腸道屏障功能及腸道動力的改變,為進一步研究微生態(tài)-腸-腦軸在ASD發(fā)病機制中的作用及益生菌對ASD的治療作用提供理論基礎。材料與方法:1.研究使用兩種ASD小鼠模型,分別為基因突變鼠BTBR T~+Itpr3tf/JNju(BTBR組)和C57bl/6J雌鼠孕期腹腔注射丙戊酸鈉造模(VPA組)。具體如下:C57bl/6J雌鼠和雄鼠交配,于孕12.5天皮下注射VPA或生理鹽水。BTBR雌鼠與雄鼠交配。各組幼崽于3周斷奶后,每窩隨機選擇2只雄鼠,納入相應組別。部分小鼠于3周處死以評價3周齡ASD小鼠的腸道屏障功能改變。其余各組小鼠于6-10周進行行為學檢測,檢測結束后取小鼠糞便,之后處死小鼠,取結腸組織進行后續(xù)檢測。2.3周齡小鼠腸道屏障功能檢測:FITC-葡聚糖灌胃后光譜儀檢測小鼠血清中FITC-葡聚糖的水平;Western Blot檢測各組小鼠結腸Trek1,claudin1,claudin3,occludin及ZO-1的表達;qPCR檢測各組小鼠結腸IL-6,TNF-α和IFN-γ的表達。3.行為學檢測:各組幼崽于出生后8天行超聲檢測幼崽發(fā)聲情況,自第6周開始按如下順序進行實驗:曠場實驗、埋珠實驗、三室社交實驗、發(fā)聲檢測和自我梳理實驗。每次檢測均間隔5天。4.評估小鼠腸道功能:糞便含水量及小腸推進率。5.對各組小鼠糞便細菌16S r RNA基因的V3-V4高變區(qū)進行測序,并分析其菌群組成及結構差異。6.HPLC檢測各組小鼠糞便短鏈脂肪酸的含量。7.成年小鼠腸道屏障功能檢測:FITC-葡聚糖灌胃后光譜儀檢測小鼠血清中FITC-葡聚糖的水平;Western Blot檢測各組小鼠結腸Trek1,claudin1,claudin3,occludin及ZO-1的表達;qPCR檢測各組小鼠結腸IL-6,TNF-α和IFN-γ的表達。結果:1.行為學檢測結果:BTBR組幼鼠及VPA組幼鼠在20-50kHz和50-100kHz頻率范圍的發(fā)聲次數(shù)及持續(xù)時間較對照組顯著降低(P0.05)。與對照組相比,BTBR組成年小鼠及VPA組成年小鼠穿越曠場中間區(qū)次數(shù)及停留時間顯著降低;于目標小鼠側室的停留時間率顯著降低(P0.05);埋珠率及自我梳理時間均顯著升高(P0.05);在20-50kHz和50-100kHz頻率范圍的發(fā)聲次數(shù)及持續(xù)時間均顯著降低(P0.05)。2.3周齡小鼠腸道屏障功能:BTBR組及VPA組小鼠血清中FITC-葡聚糖的水平均較對照組小鼠顯著升高,結腸Trek1,claudin1,claudin3及occludin蛋白的表達較對照組降低,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。而BTBR組及VPA組小鼠結腸ZO-1的表達與對照組相比無顯著差異(P0.05)。BTBR組小鼠結腸IL-6,TNF-α及IFN-γmRNA的表達較對照組顯著升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。與對照組相比,VPA組小鼠結腸IL-6和TNF-αmRNA的表達顯著升高(P0.05);而IFN-γmRNA的表達則無明顯差異(P0.05)。3.小鼠腸道功能:與對照組相比,BTBR組小鼠糞便含水量顯著降低(P0.05);而VPA組小鼠糞便含水量與對照組相比無明顯差異(P0.05)。BTBR組和VPA組小鼠小腸推進率與對照組相比,差異均無統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.菌群測序結果:BTBR組小鼠腸道菌群的sobs、chao、ace、shannon、shannoneven和simpsoneven指數(shù)值較對照組均降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);而simpson指數(shù)值較對照組升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。VPA組小鼠腸道菌群的上述各指數(shù)值與對照組相比,均無顯著差異(P0.05)。BTBR組、VPA組與對照組小鼠腸道菌群構成存在差異。在門水平:與對照組相比,BTBR組小鼠糞便Firmicutes和unclassified_K_norank比例顯著升高,Bacteroidetes、Saccharibacteria和Spirochaetae比例顯著降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);VPA組小鼠糞便Spirochaetae和Verrucomicrobia比例較對照組顯著降低(P0.05)。5.糞便短鏈脂肪酸含量:BTBR組小鼠糞便中乙酸、丁酸和戊酸水平較對照組均顯著降低(P0.05),丙酸水平無顯著差異(P0.05)。與對照組相比,VPA組小鼠丙酸水平顯著升高,丁酸水平顯著降低(P0.05);乙酸及戊酸水平無顯著差異(P0.05)。6.成年小鼠腸道屏障功能:BTBR小鼠及VPA小鼠血清中FITC-葡聚糖的水平均較對照組小鼠升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。BTBR組及VPA組小鼠結腸Trek1、claudin1、claudin3及occludin蛋白的表達較對照組降低,結腸IL-6、TNF-α和IFN-γmRNA的表達較對照組顯著升高,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05);而BTBR組及VPA組小鼠結腸ZO-1的表達與對照組相比無統(tǒng)計學差異(P0.05)。結論:BTBR及VPA模型小鼠均表現(xiàn)出與ASD患者類似的廣泛行為障礙,腸道菌群構成的改變及糞便丁酸水平的降低。BTBR小鼠及VPA模型小鼠在3周即表現(xiàn)出腸道Trek1及緊密連接蛋白表達下調(diào),腸道屏障通透性及促炎細胞因子水平的增高;上述腸道改變在兩種ASD模型小鼠成年期仍存在。第三部分酪酸梭菌改善自閉癥譜系障礙小鼠的腸道屏障功能和行為癥狀目的:驗證如下假說:在自閉癥譜系障礙小鼠中,酪酸梭菌及其代謝產(chǎn)物丁酸能上調(diào)腸道Trek1及緊密連接蛋白的表達、降低促炎細胞因子的水平,改善腸道屏障功能,并減輕ASD行為癥狀。材料與方法:1.在第二部分BTBR及VPA自閉癥譜系障礙小鼠模型的基礎上進行酪酸梭菌灌胃處理。實驗分5組:對照組、BTBR組、BTBR+酪酸梭菌處理組、丙戊酸鈉組、丙戊酸鈉+酪酸梭菌處理組。酪酸梭菌處理組小鼠3周斷奶后給予0.5ml酪酸梭菌灌胃,連續(xù)21天;其余各組給予等體積生理鹽水灌胃。灌胃結束5天后進行各項行為學檢測,之后取小鼠糞便,處死小鼠并取結腸組織進行后續(xù)檢測。2.行為學檢測:按如下順序進行實驗:曠場實驗、埋珠實驗、三室社交實驗、發(fā)聲檢測、自我梳理實驗。每次檢測均間隔5天。3.HPLC檢測各組小鼠糞便中丁酸的含量。4.腸道通透性檢測:FITC-葡聚糖灌胃后光譜儀檢測小鼠血清中FITC-葡聚糖的水平。5.Western Blot檢測各組小鼠結腸Trek1,HDAC1,claudin1,claudin3及occludin的表達;qPCR檢測小鼠結腸Trek1,HDAC1,claudin1,claudin3及occludin的表達;免疫組化檢測各組小鼠結腸黏膜Trek1的表達。6.ELISA檢測各組小鼠結腸IL-6,TNF-α和IFN-γ的水平。結果:1.BTBR組及VPA組小鼠糞便中酪酸梭菌水平極低,酪酸梭菌灌胃后,ASD模型小鼠的糞便酪酸梭菌和丁酸含量顯著升高(P0.05)。2.BTBR+酪酸梭菌組小鼠及VPA+酪酸梭菌組小鼠血清中FITC-葡聚糖的水平均較相應ASD組小鼠顯著降低(P0.05)。3.WB結果顯示:酪酸梭菌處理可以增加BTBR及VPA模型小鼠結腸Trek1、claudin1、claudin3及occludin蛋白的表達,降低HDAC1蛋白的表達,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。qPCR及免疫組化的檢測結果與WB相一致。4.BTBR+酪酸梭菌組小鼠及VPA+酪酸梭菌組小鼠結腸IL-6,TNF-α和IFN-γ水平較相應ASD組小鼠顯著降低(P0.05)。5.行為學檢測:酪酸梭菌處理能使BTBR和VPA模型小鼠穿越曠場中間區(qū)次數(shù)及停留時間顯著升高;目標小鼠側室的停留時間率顯著升高;埋珠率和自我梳理時間顯著降低;20-50kHz和50-100kHz頻率范圍的發(fā)聲次數(shù)及持續(xù)時間顯著升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論:在兩種ASD小鼠模型中,應用酪酸梭菌處理能抑制腸道HDAC1的表達,上調(diào)Trek1及緊密連接蛋白的表達、下調(diào)促炎細胞因子的水平,增強腸道屏障功能,并改善ASD樣行為癥狀。第四部分酪酸梭菌通過Trek1調(diào)節(jié)自閉癥譜系障礙小鼠腸道屏障功能目的:探索酪酸梭菌/丁酸鈉對自閉癥譜系障礙小鼠腸上皮屏障的作用靶點。材料與方法:1.C57bl/6J雄鼠隨機分為兩組,Con組和Con+spadin組。分別應用0.1ml生理鹽水和spadin溶液對雄性C57bl/6J小鼠進行腹腔注射,每天1次,連續(xù)15天。結束后檢測兩組小鼠腸道屏障通透性。2.BTBR雄鼠在3周斷奶后隨機分為六組:BTBR組(Saline組)、BTBR+spadin組(SPA組)、BTBR+酪酸梭菌組(CB組)、BTBR+酪酸梭菌+spadin組(CB/SPA組)、BTBR+丁酸鈉組(SB組)、BTBR+丁酸鈉+spadin組(SB/SPA組)。酪酸梭菌處理組小鼠給予0.5ml酪酸梭菌懸液灌胃;丁酸鈉處理組給予0.5ml丁酸鈉灌胃,余各組小鼠給予等體積生理鹽水灌胃。所有小鼠給予0.1ml spadin或等體積生理鹽水腹腔注射。上述操作均每天1次,連續(xù)21天。3.腸道通透性檢測:FITC-葡聚糖灌胃后光譜儀檢測各組小鼠血清中FITC-葡聚糖的水平。4.腸道緊密連接蛋白:WB檢測各組小鼠結腸claudin1,claudin3及occludin的表達。5.細胞因子檢測:ELISA檢測各組小鼠結腸IL-6,TNF-α和IFN-γ的水平。結果:1.對C57bl/6J小鼠進行spadin處理后,小鼠外周血中FITC-葡聚糖的水平顯著升高(P0.05)。2.與CB組相比,CB/SPA組小鼠外周血中FITC-葡聚糖的水平顯著升高;與SB組相比,SB/SPA組小鼠外周血中FITC-葡聚糖的水平顯著升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3.Spadin處理降低CB和SB治療小鼠結腸claudin1、claudin3及occludin蛋白的表達量(P0.05)。4.CB/SPA組和SB/SPA組小鼠分別較CB組和SB組結腸IL-6,TNF-α的水平升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論:Trek1是酪酸梭菌/丁酸改善ASD模型小鼠腸道屏障功能的作用靶點。結合本研究第三部分,在ASD小鼠模型中,酪酸梭菌/丁酸作為HDAC1抑制劑,通過上調(diào)腸道Trek1的表達,進而改善腸道屏障功能及ASD核心行為癥狀。
【學位單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R749.94
【部分圖文】：

3 2 0：*P<0.05 vs 對照組。SD 組兒童行為癥狀嚴重程度 ATEC 量表評估，ASD 組兒童行為癥狀的評分分別為：語言（18.14±27.83±3.84），感覺知覺（22.97±4.49）和健康/身體/行為（31.45±6童糞便 SCFA 含量LC 檢測 SCFA 的混標圖及標準曲線見附圖 1.1 及附圖 1.2。兒的含量見圖 1.1。ASD 組兒童糞便乙酸水平（732.4±229.8）較±204.4，P=0.011）顯著降低。兩組兒童糞便中丙酸的水平?jīng)]有統(tǒng)0.243）。與對照組兒童（563.3±186.7）相比，ASD 組兒童糞便丁酸（413.2±172.3，P=0.005）。而 ASD 組兒童糞便戊酸水平（1646.9±4于對照組兒童（615.8±221.0，P<0.001）。

圖 1.2 ASD 和對照組兒童腸道菌群多樣性a：OTU 水平 alpha 多樣性 shannon 指數(shù) b：OTU 水平 alpha 多樣性 shannoneven 指數(shù) c：OTU 水平 PCoA 分析（*P<0.05 vs 對照組）

圖 1.2 ASD 和對照組兒童腸道菌群多樣性平 alpha 多樣性 shannon 指數(shù) b：OTU 水平 alpha 多樣性 shannonevOTU 水平 PCoA 分析（*P<0.05 vs 對照組）
【參考文獻】

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1 吳梅榮;徐海青;;孤獨癥早期診斷生物學標記研究進展[J];中國兒童保健雜志;2015年09期

本文編號：2858420