目的探討人巨細胞病毒在與心肌細胞損害之間的關系,為臨床病毒性心肌炎病原學研究和診斷提供理論依據(jù)。方法本實驗分體外及體內兩部分:(一)體外部分:第一部分是SD大鼠原代心肌細胞培養(yǎng)。取出生1-3天的SD大鼠15只,無菌取其心室肌用0.25%胰蛋白酶消化后制成心肌單細胞懸液,移入培養(yǎng)瓶進行培養(yǎng)。第二部分是用HCMV病毒感染新生的SD大鼠的培養(yǎng)心肌細胞。取長成單層的乳鼠心肌細胞,分成二組:○1細胞對照組○2病毒感染組。在病毒感染組細胞中每孔加0.5ml含100TCID50HCMV的生長液,對照組僅加入等量的生長液。37℃溫育2h后,各組棄上清液,加生長液1ml/孔,置37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待病毒對照組CPE(++++)時,停止培養(yǎng),觀察感染后的細胞病變、搏動情況,取各組細胞培養(yǎng)液上清,檢測培養(yǎng)液中心肌谷草轉氨酶(AST)乳酸脫氫酶(LDH),肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)及肌鈣蛋白(cTnI)水平的改變并通過形態(tài)學鑒定HCMV在心肌細胞內感染狀況。(二)體內部分:以HCMV誘導BALB/C小鼠心肌炎模型。將30只小鼠分為A、B、C三組,每組10只。其中A組為HCMV感染組,腹腔注射HCMV AD169株懸液0.5ml/只;B組為HF對照組,腹腔注射HF懸液0.5ml/只;C組為DMEM對照組,腹腔注射DMEM懸液0.5ml/只。分別與注射后第20天取血、心肌標本,進行心肌病毒分離及病理和電鏡檢測。結果體外部分:培養(yǎng)的SD新生乳鼠心肌細胞感染HCMV后,細胞逐步出現(xiàn)病變,細胞停止搏動,在第5天及第7天的培養(yǎng)液中AST、LDH、CK、CK-MB、cTnI均明顯高于細胞對照組(p0.05),同時HCMV pp65蛋白免疫熒光及免疫組化等檢測亦為陽性。體內部分:HCMV感染小鼠心肌炎總發(fā)病率為80.0%,感染組分別在病毒感染后的第5～10天各死亡一只,死亡率為20.0%。HCMV感染后的第5-20天,病理HE染色可見心肌細胞出現(xiàn)腫脹、變性、血管周圍可見有大量的炎性細胞浸潤,電鏡下心肌細胞內可見有巨細胞病毒顆粒。結論1、HCMV AD169株使體外心肌細胞形態(tài)學及酶學發(fā)生了改變,體內心肌細胞發(fā)生炎癥反應,說明HCMV可能具有感染鼠心肌細胞的能力。2、HCMV可能是病毒性心肌炎的重要病原體之一。在臨床治療小兒病毒性心肌炎時,應結合病原學檢測,考慮針對HCMV的抗病毒治療。
【學位單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2009
【中圖分類】：R725.4
【部分圖文】：

16圖 1 正常乳鼠心肌細胞的形態(tài)（×400）將 HCMV AD169 株細胞懸液接種在心肌細胞后的 2-3 天內,細胞搏動變慢且不規(guī)則,CPE 不明顯；在接種后的第 4 天，心肌細胞搏動明顯減少，部分細胞已完全停止搏動。細胞胞漿中出現(xiàn)大量的空泡，折光性減弱,部分細胞出現(xiàn)了團縮，如圖 2 所示

圖 2 HCMV 感染乳鼠心肌細胞的形態(tài)（×400）3.1.2 HCMV 病毒的感染力（TCID50）實驗時將保存病毒株傳一代后，培養(yǎng)瓶迅速凍融 3 次，離心去細胞碎片。滴定后實驗結果：按 Read-Much 公式計算 TCID50為 10-4.7。3..1.3 心肌酶及心肌 cTnI 的測定如表 1 所示，在心肌細胞感染 HCMV 后的第 3 天時，AST、CK、CK-MB及 cTnI 與正常對照組相比無顯著性差異（p>0.05）,而在第 5 天及第 7 天時 AST、LDH、CK、CK-MB 及 cTnI 均明顯高于正常對照組（p<0.05）。說明在感染 HCMV5天后心肌細胞已出現(xiàn)了損傷，且隨著感染的延伸其心肌酶有逐漸升高趨勢。

3.1.4 HCMV 感染心肌細胞免疫熒光結果用 HCMV pp65 單克隆抗體對 HCMV 感染的 SD 大鼠乳鼠的心肌細胞進行免疫熒光檢測，我們可見有蘋果綠色熒光陽性信號位于被感染的心肌細胞的胞核中。如圖 3 所示。陰性對照未見任何陽性信號。3.1.5 HCMV 感染心肌細胞表達早期蛋白用鼠抗人巨細胞病毒（CMV-EA）單克隆抗體與 HCMV 感染的 SD 大鼠乳鼠的心肌細胞作用，在倒置顯微鏡下觀察，可見有紅褐色的陽性信號位于被感染的心肌細胞的胞核中。如圖 4 所示。

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本文編號：2829462