【摘要】： 敗血癥(sepsis)是一種嚴(yán)重的細(xì)菌性感染疾病,在新生兒中具有較高的死亡率,發(fā)病隱匿,臨床癥狀無特異性。因此,尋找一種快速、準(zhǔn)確的敗血癥早期診斷方法,對指導(dǎo)臨床治療、降低患兒死亡率、改善預(yù)后,具有十分重要的意義。目前,細(xì)菌培養(yǎng)是作為“金標(biāo)準(zhǔn)”在診斷臨床細(xì)菌性病原微生物標(biāo)本,然而該方法缺乏快速和敏感性。在本研究中,我們分析細(xì)菌16s rRNA基因序列,在其保守區(qū)設(shè)計(jì)通用引物和革蘭陰、陽性菌分型探針,建立了細(xì)菌革蘭雙檢熒光定量PCR新方法,并對臨床的相關(guān)標(biāo)本進(jìn)行了檢測。本研究分二部分:第一部分,細(xì)菌革蘭雙檢熒光定量PCR技術(shù)的建立;第二部分,細(xì)菌革蘭雙檢熒光定量PCR技術(shù)臨床應(yīng)用。 第一部分細(xì)菌革蘭雙檢熒光定量PCR技術(shù)的建立 方法: 分析臨床常見菌16S rRNA基因序列,在高度保守區(qū)自行設(shè)計(jì)通用引物和革蘭陽性和陰性分型探針,建立細(xì)菌革蘭陰、陽性菌雙通道熒光定量PCR檢測體系,選取臨床較常見的53株臨床分離株(25株為革蘭陽性菌、28株為革蘭陰性菌)進(jìn)行細(xì)菌革蘭雙檢熒光定量PCR方法檢測,以評價(jià)該方法探針的特異性;以金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌分別代表革蘭陽性和陰性菌進(jìn)行濃度梯度稀釋,稀釋品進(jìn)行該方法的檢測以評價(jià)細(xì)菌革蘭雙檢熒光定量PCR的敏感度和線性關(guān)系。 結(jié)果: 細(xì)菌革蘭雙檢熒光定量PCR具有較好的敏感性和特異性,最低能檢測到3個(gè)金黃色葡萄球菌,而大腸桿菌可以檢測低到1個(gè)細(xì)菌數(shù)。53株臨床培養(yǎng)分離株進(jìn)行該方法檢測:25株革蘭陽性菌株通過革蘭陽性探針(FAM-G~+探針)檢測均為陽性,28株革蘭陰性菌株通過革蘭陰性探針(VIC-G~-探針)檢測均為陽性,反之均為陰性,符合率100%。巨細(xì)胞病毒、EB病毒、乙肝病毒,新型隱球菌及白色念珠菌,人基因組DNA及空白對照均為陰性。 結(jié)論: 建立了用通用弓J物和分型雙熒光探針的細(xì)菌革蘭雙檢熒光定量PCR方法。其檢測快速、準(zhǔn)確,具有較大的臨床推廣應(yīng)用和臨床指導(dǎo)用藥價(jià)值。 第二部分細(xì)菌革蘭雙檢熒光定量PCR技術(shù)臨床應(yīng)用 方法: 用建立的細(xì)菌革蘭雙檢熒光定量PCR方法對1000例臨床疑似為敗血癥的患兒血標(biāo)本和125份擬診為化膿性腦膜炎的腦脊液標(biāo)本,進(jìn)行該方法的檢測,同時(shí)進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)對照實(shí)驗(yàn),檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果: 1.在1000例血標(biāo)本中,細(xì)菌革蘭雙檢熒光定量PCR共檢出64例陽性標(biāo)本,其中革蘭陽性菌40例,革蘭陰性菌24例,陽性率為6.40%(64/1000);血培養(yǎng)共檢出50例陽性,陽性率為5.00%(50/1000),陽性率前者高于后者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。 2.在125份腦脊液標(biāo)本中,細(xì)菌革蘭雙檢熒光定量PCR共檢出17份陽性,其中革蘭陽性菌為10份,革蘭陰性菌為7份,陽性率為13.6%(17/125);腦脊液細(xì)菌培養(yǎng)共檢出6份陽性,陽性率為4.8%(6/125);陽性率前者顯著高于后者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。 3.以細(xì)菌培養(yǎng)為對照,對血標(biāo)本和腦脊液標(biāo)本進(jìn)行匯總,細(xì)菌革蘭雙檢熒光定量PCR的檢測敏感度為91.07%,特異性為97.36%,約登指數(shù)為0.8843,檢測符合率為97.05%,kappa值0.89。 結(jié)論: 建立的細(xì)菌革蘭雙檢熒光定量PCR技術(shù)新方法用于臨床標(biāo)本(包括血、腦脊液)的檢測,具有快速、特異、敏感的特點(diǎn),可為臨床早期、準(zhǔn)確診斷敗血癥和化腦等細(xì)菌性感染疾病提供新方法。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R725.1
【圖文】：

與此同時(shí)該28株革蘭陰性菌在FAM通道(FAM一G十探針)均為陰性(表l)。人巨細(xì)胞病毒、EB病毒、乙肝病毒，新型隱球菌、白色念珠菌、人基因組DNA以及空白對照等檢測結(jié)果均為陰性(圖2.1，2.2，2.3)鑿鑿忿輝盟黔哩望矍罐寒耀哪檬辮群擎卿豁瞬麟麒姍瀚 !!!隊(duì) 隊(duì)M一G一通i笆一一卡 卡一 一‘人~一一一一一一一‘癡高‘‘‘盆一____山一一一一一 一圖2.1表皮葡萄球菌革蘭雙檢熒光定量圖{TI，:二滬鉀尸，、.，，，1.

空白對照組革蘭雙檢熒光定量圖

對上述構(gòu)建的金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌 165rRNA基因重組質(zhì)粒進(jìn)行測序驗(yàn)證，經(jīng)與基因庫中相應(yīng)細(xì)菌序列比較，其同源性均大于98%(部分測序圖見圖2.4，2.5)。分別取該重組質(zhì)粒經(jīng)紫外分光廣度計(jì)初步定量后的濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品loo/ul一ros/ul進(jìn)行細(xì)菌革蘭雙檢熒光定量PcR，結(jié)果發(fā)現(xiàn)革蘭陽性菌探針對金黃色葡萄球菌的重組質(zhì)粒從10’/ul一1護(hù)/ul具有良好的線性關(guān)系，而革蘭陰性菌探針對大腸埃希菌的重組質(zhì)粒從100/ul一105/ul均具有良好的線性關(guān)系(圖2.6，2.7)o1001101201301叨1501‘01，0圖2.4金黃色葡萄球菌部分序列分析圖100C人GC人C1101201301401501601，0ll

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2801441