腸道病毒71型手足口病血清學(xué)ELISA診斷試劑盒制備和初步評(píng)價(jià)
發(fā)布時(shí)間：2020-08-09 22:37
【摘要】： 目的研制早期快速檢測(cè)抗腸道病毒71型(EV71)抗體的ELISA血清學(xué)診斷性試劑盒,評(píng)價(jià)其臨床應(yīng)用價(jià)值。 方法將表達(dá)純化的EV71重組蛋白VP1作為包被抗原,建立EV71型手足口病間接ELISA法的血清學(xué)檢測(cè)方法。通過(guò)與逆轉(zhuǎn)錄(RT)PCR方法、EV71病毒分離試驗(yàn)和微量血清中和試驗(yàn)比較,評(píng)價(jià)抗-EV71 IgM和抗-EV71 IgG血清學(xué)診斷方法在EV71型手足口病的診斷價(jià)值,并進(jìn)行臨床考評(píng)。 結(jié)果與RT-PCR比較,抗-EV71 IgM敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為83%,85%,81%和87%;抗-EV71 IgG敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為72%,74%,68%和77%。與EV71病毒分離方法比較,抗-EV71 IgM敏感度、特異度分別為85%和97%;抗-EV71 IgG敏感度、特異度分別為75%和77%。通過(guò)直線相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),抗-EV71 IgG抗體滴度和中和抗體滴度呈顯著正相關(guān)(r =0.72,P0.001)。EV71型手足口病患兒恢復(fù)期血清抗IgG滴度較急性期升高(P0.001),但抗IgM滴度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.287)。重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)小于10%。臨床100份樣本檢測(cè),抗EV71IgM抗體靈敏度與特異度均超過(guò)85%。試劑放置4周后,檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定。 結(jié)論利用VP1重組蛋白作為包被抗原,成功開發(fā)ELISA檢測(cè)人血清抗-EV71 IgM和抗-EV71 IgG抗體的診斷試劑盒。
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R725.1
【圖文】：
檢測(cè)抗 EV71 EV71IgM,IgG 抗體手足口病 EV71 抗體診斷性試劑盒V71 流行病學(xué)調(diào)查，EV71 陽(yáng)性患者愈后抗體持續(xù)水平研究離及鑒定染細(xì)胞后，大多能引起細(xì)胞病變（cytopathic effect，CPE），、壞死、破碎或脫落，EV71的CPE現(xiàn)象無(wú)需染色便可直接在觀察，記錄時(shí)+代表25%以下細(xì)胞發(fā)生病變，++代表50%左右+代表75%左右，++++代表100%左右細(xì)胞發(fā)生病變。圖1顯示所出現(xiàn)的CPE現(xiàn)象。某些病毒在初次接種后便出現(xiàn)明顯CPE，續(xù)3－4次傳代后才能出現(xiàn)，若超過(guò)5代仍沒有出現(xiàn)CPE，則證敗，或者樣本中根本就沒有所要分離的病毒。
結(jié) 果細(xì)胞（CPE）的細(xì)胞（圖 2）制備抗原片，加入用間接免疫熒光法鏡檢病毒。熒光顯微鏡下觀察熒光為黃綠色顆粒，分布在感染細(xì)胞的胞漿內(nèi)熒光為陰性。（圖 2C）
17圖3 腸道病毒（EV71、CA16）RT-PCR電泳圖注：A 圖為腸道病毒EV71電泳圖 B 圖為腸道病毒CA16電泳圖A1 陽(yáng)性條帶 A2 陰性條帶 A3 陽(yáng)性對(duì)照 A4 陰性對(duì)照 AM Marker DL100B1 陰性對(duì)照 B2 陽(yáng)性對(duì)照 B3 陰性條帶 B4 陽(yáng)性條帶 BM Marker DL20003.3 表達(dá)重組VP1蛋白3.3.1 VP1基因的擴(kuò)增和重組pET-21b(+)-VP1陽(yáng)性質(zhì)粒的鑒定提取EV71 流行株的病毒RNA作為PCR擴(kuò)增模板進(jìn)行RT-PCR，電泳結(jié)果顯示可以擴(kuò)增出891bp左右特異的V P1基因片段(圖1A)。pET-21b:VP1陽(yáng)性重組質(zhì)粒分別經(jīng)EcoR I和Hind III進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳分別見到約891bp和5.5kb兩條片段(圖1B)。以重組陽(yáng)性質(zhì)粒為模板，利用PCR擴(kuò)增出大小約891bp的特異性片段(圖1C)。重組質(zhì)粒pET-21b:VP1經(jīng)測(cè)序，確定重組質(zhì)粒pET-21b:VP1中正確插入VP1基因，表明重組質(zhì)粒pET-21b:VP1構(gòu)建成功。3.3.2 VP1重組蛋白的表達(dá)、純化與鑒定表達(dá)的重組菌裂解液經(jīng)12％SDS-PAGE電泳分離，Coomassie blue 染色后，在約35kD處出現(xiàn)一條明顯的蛋白條帶(見圖4A)
本文編號(hào)：2787652
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R725.1
【圖文】：
檢測(cè)抗 EV71 EV71IgM,IgG 抗體手足口病 EV71 抗體診斷性試劑盒V71 流行病學(xué)調(diào)查，EV71 陽(yáng)性患者愈后抗體持續(xù)水平研究離及鑒定染細(xì)胞后，大多能引起細(xì)胞病變（cytopathic effect，CPE），、壞死、破碎或脫落，EV71的CPE現(xiàn)象無(wú)需染色便可直接在觀察，記錄時(shí)+代表25%以下細(xì)胞發(fā)生病變，++代表50%左右+代表75%左右，++++代表100%左右細(xì)胞發(fā)生病變。圖1顯示所出現(xiàn)的CPE現(xiàn)象。某些病毒在初次接種后便出現(xiàn)明顯CPE，續(xù)3－4次傳代后才能出現(xiàn)，若超過(guò)5代仍沒有出現(xiàn)CPE，則證敗，或者樣本中根本就沒有所要分離的病毒。
結(jié) 果細(xì)胞（CPE）的細(xì)胞（圖 2）制備抗原片，加入用間接免疫熒光法鏡檢病毒。熒光顯微鏡下觀察熒光為黃綠色顆粒，分布在感染細(xì)胞的胞漿內(nèi)熒光為陰性。（圖 2C）
17圖3 腸道病毒（EV71、CA16）RT-PCR電泳圖注：A 圖為腸道病毒EV71電泳圖 B 圖為腸道病毒CA16電泳圖A1 陽(yáng)性條帶 A2 陰性條帶 A3 陽(yáng)性對(duì)照 A4 陰性對(duì)照 AM Marker DL100B1 陰性對(duì)照 B2 陽(yáng)性對(duì)照 B3 陰性條帶 B4 陽(yáng)性條帶 BM Marker DL20003.3 表達(dá)重組VP1蛋白3.3.1 VP1基因的擴(kuò)增和重組pET-21b(+)-VP1陽(yáng)性質(zhì)粒的鑒定提取EV71 流行株的病毒RNA作為PCR擴(kuò)增模板進(jìn)行RT-PCR，電泳結(jié)果顯示可以擴(kuò)增出891bp左右特異的V P1基因片段(圖1A)。pET-21b:VP1陽(yáng)性重組質(zhì)粒分別經(jīng)EcoR I和Hind III進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳分別見到約891bp和5.5kb兩條片段(圖1B)。以重組陽(yáng)性質(zhì)粒為模板，利用PCR擴(kuò)增出大小約891bp的特異性片段(圖1C)。重組質(zhì)粒pET-21b:VP1經(jīng)測(cè)序，確定重組質(zhì)粒pET-21b:VP1中正確插入VP1基因，表明重組質(zhì)粒pET-21b:VP1構(gòu)建成功。3.3.2 VP1重組蛋白的表達(dá)、純化與鑒定表達(dá)的重組菌裂解液經(jīng)12％SDS-PAGE電泳分離，Coomassie blue 染色后，在約35kD處出現(xiàn)一條明顯的蛋白條帶(見圖4A)
【參考文獻(xiàn)】
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1 王松;許誠(chéng);張紅梅;劉勇軍;劉威龍;徐六妹;譚艷;謝靖婧;陳心春;;RT-PCR檢測(cè)手足口病病原體EV71[J];中華實(shí)驗(yàn)和臨床感染病雜志(電子版);2008年04期
2 劉寶芳;李玉杰;顧偉玲;王霞;;980例手足口病臨床分析[J];中華實(shí)驗(yàn)和臨床感染病雜志(電子版);2009年03期
本文編號(hào)：2787652
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