【摘要】： 幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎(juvenile idiopathic arthritis，JIA)是一組由多因素誘導(dǎo)的自身免疫性慢性結(jié)締組織綜合癥。它涵蓋以往的幼年類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，JRA)和幼年慢性關(guān)節(jié)炎。其并發(fā)癥和后遺癥是兒童后天致殘的主要原因之一。其病因至今不明，主要認(rèn)為是由于感染、遺傳、環(huán)境、內(nèi)分泌、神經(jīng)調(diào)節(jié)等因素引起機(jī)體免疫紊亂而形成反復(fù)慢性炎癥所致。治療十分棘手，因此，對(duì)其發(fā)生機(jī)制的探討和尋找合理有效的治療途徑十分重要。 樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)作為專(zhuān)職抗原提呈細(xì)胞(antigenpresenting cell，APC)，抗原提呈能力獨(dú)特，在免疫應(yīng)答啟動(dòng)、調(diào)節(jié)和效應(yīng)等各個(gè)環(huán)節(jié)，均發(fā)揮關(guān)鍵性的作用。因此，最近DC在慢性感染、自身免疫病和腫瘤等一系列疾病中所發(fā)揮的作用備受重視。 最近研究表明，膽堿能抗炎通路(cholinergic anti-inflammatory pathway)是機(jī)體重要的抗炎機(jī)制之一。免疫細(xì)胞如T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞存在固有膽堿能系統(tǒng)，是膽堿能系統(tǒng)抗炎通路的重要組成部分。免疫細(xì)胞膽堿能物質(zhì)可能是免疫系統(tǒng)與神經(jīng)系統(tǒng)聯(lián)系的物質(zhì)基礎(chǔ)，兩者吻合的關(guān)鍵分子之一是煙堿樣乙酰膽堿能受體(nicotineic acetylcholinergic receptor，nAChR)。該通路出現(xiàn)異常，會(huì)導(dǎo)致全身性炎癥反應(yīng)，如引起類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)等自身免疫病的的發(fā)生，而刺激小鼠迷走神經(jīng)可減輕全身炎性反應(yīng)。最近有學(xué)者提出RA可能與迷走神經(jīng)功能缺陷有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)室前期工作已表明膠原性關(guān)節(jié)炎與機(jī)體的固有膽堿能系統(tǒng)物質(zhì)表達(dá)降低有關(guān)。白三烯B4(leukotriene B4，LTB4)與白三烯B4受體(leukotriene B4 receptor，BLT)信號(hào)通路LTB4-BLT(包括LTB4-BLT1和LTB4-BLT2)參與機(jī)體的炎癥病理反應(yīng)。它是機(jī)體炎癥反應(yīng)的早期“預(yù)警信號(hào)”(alarm signal)，在機(jī)體炎癥早期免疫放大中起關(guān)鍵作用。有人提出在RA發(fā)病中LTB4-BLT2信號(hào)通路可能比LTB4-BLT1發(fā)揮更大作用。 樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)作為抗原提呈功能最強(qiáng)的APC，是否存在固有膽堿能系統(tǒng)和LTB4-BLT信號(hào)通路，它們?cè)谘装Y免疫中發(fā)揮怎樣的作用?尚無(wú)系統(tǒng)研究。因此，探討DC的固有膽堿能系統(tǒng)，以及與LTB4-BLT信號(hào)通路的關(guān)系，對(duì)于探討JIA等一類(lèi)風(fēng)濕性自身免疫病的炎癥機(jī)制及其治療策略可能有重要意義。 本研究旨在探討DC是否具有膽堿能系統(tǒng)成分(nAChRα7、ChAT和AChE)和LTB4-BLT信號(hào)通路物質(zhì)，以及膽堿能系統(tǒng)和LTB4-BLT2信號(hào)通路在JIA炎癥反應(yīng)中的作用。全文分三部分，結(jié)果簡(jiǎn)述如下。 第一部分小鼠骨髓來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng) 目的： DC獲取困難。旨在建立小鼠骨髓前體細(xì)胞分離培養(yǎng)DC的方法。優(yōu)化條件，克服影響DC誘導(dǎo)、分化、成熟和消化的相關(guān)因素，并在細(xì)胞形態(tài)、表面標(biāo)志分子及分泌細(xì)胞因子方面予以鑒定。 方法： 1．無(wú)菌分離正常BALB／c小鼠骨髓細(xì)胞，體外用細(xì)胞因子包括重組小鼠白細(xì)胞介素-4(interleukin-4，rmIL-4)和重組粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(recombinate mouse granulocyte-colony stimulating factor，rmGM-CSF)誘導(dǎo)、分化為幼稚DC，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激獲取成熟DC。 2．光學(xué)顯微鏡觀察DC形態(tài)變化。 3．采用新鮮配制0.4％胰酶37℃消化細(xì)胞。 4．流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC標(biāo)志分子。 5．ELISA方法檢測(cè)幼稚和成熟DC培養(yǎng)上清中白細(xì)胞介素-12(interleukin-12，IL-12)含量。 結(jié)果： 1．純化后獲取的骨髓細(xì)胞與rmIL-4及rmGM-CSF共同培養(yǎng)4h即可看到細(xì)胞貼壁，2d可看到少許細(xì)胞突起，細(xì)胞體積逐漸長(zhǎng)大，3d后細(xì)胞形狀不規(guī)則且毛刺狀突起增多，逐漸增長(zhǎng)，呈幼稚狀態(tài)DC的形態(tài)學(xué)改變。培養(yǎng)到6d，加入LPS 24h-48h后，細(xì)胞分化程度更高，呈現(xiàn)成熟狀態(tài)DC的典型樹(shù)突改變。同時(shí)，觀察到具有樹(shù)突形狀的細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的平均數(shù)為85％—90％。 2．DC相對(duì)特異標(biāo)志分子CD_(11)c、主要組織相容性復(fù)合分子MHC—Ⅱ、共刺激分子CD80和CD86于DC成熟前后表達(dá)率(％)分別為41.783±6.106、32.300±4.586、21.683±2.875、27.523±3.708和75.687±11.671、71.767±9.199、63.293±8.119、71.970±10.485。表明隨DC的成熟，其表面標(biāo)志分子表達(dá)明顯增多，成熟狀態(tài)與幼稚狀態(tài)比較(p＜0.01)。 3．幼稚和成熟DC培養(yǎng)上清中IL-12含量分別為37.7±7.6pg／ml和712±134.425pg／ml，成熟DC培養(yǎng)上清IL-12含量比幼稚DC明顯升高(p＜0.01)。 小結(jié)： 優(yōu)化條件建立體外用rmGM-CSF和rmIL-4定向誘導(dǎo)以及LPS刺激小鼠骨髓細(xì)胞培養(yǎng)DC的方法。該方法能成功培養(yǎng)出具備幼稚和成熟功能的DC。該方法誘導(dǎo)細(xì)胞分化率高、生長(zhǎng)穩(wěn)定、細(xì)胞功能完好，是本課題深入研究的技術(shù)基礎(chǔ)。 第二部分DC固有膽堿能系統(tǒng)和LTB4-BLT信號(hào)通路表達(dá) 一、成熟DC膽堿能系統(tǒng)表達(dá)以及MEC對(duì)nAChRα7表達(dá)的影響 目的： 探討成熟DC是否存固有膽堿能系統(tǒng)及其調(diào)控機(jī)制。 方法： 1．免疫細(xì)胞化學(xué)方法和免疫熒光抗體技術(shù)檢測(cè)成熟DC膽堿能系統(tǒng)(nAChRα7、ChAT和AChE)蛋白的定位表達(dá)。 2．流式細(xì)胞術(shù)分析成熟DC膽堿能系統(tǒng)(nAChRα7、ChAT和AChE)蛋白的定量表達(dá)。 3．RT-PCR方法檢測(cè)成熟DC膽堿能系統(tǒng)(nAChRα7、ChAT和AChE)mRNA表達(dá)。 4．流式細(xì)胞儀檢測(cè)非特異性阻斷劑美加明(mecamylamine，MEC)作用于成熟DC 12h對(duì)nAChRα7表達(dá)的影響。 結(jié)果： 1．成熟DC nAChRα7蛋白主要分布于細(xì)胞膜，ChAT和AChE主要分布于細(xì)胞漿。nAChRα7、ChAT及AChE蛋白表達(dá)率(％)分別為41.267±3.470、37.467±4.441和49.867±5.620，三者表達(dá)水平比較，AChE表達(dá)最強(qiáng)，與ChAT比較(p＜0.05)，與nAChRα7比較有上升趨勢(shì)。 2．成熟狀態(tài)DC均有nAChRα7、ChAT和AChE mRNA表達(dá)。 3．MEC作用12h后DC nAChRα7表達(dá)率(％)為20.651±4.374，MEC能明顯抑制nAChRα7表達(dá)，與無(wú)MEC組比較(p＜0.05)。 小結(jié)： 1．成熟DC存在固有膽堿能系統(tǒng)組成成分(nAChRα7、ChAT和AChE)。nAChRα7主要存在于DC細(xì)胞膜，而ChAT和AChE主要存在于細(xì)胞漿。DC固有膽堿能系統(tǒng)可能與炎癥免疫調(diào)節(jié)功能有關(guān)。 2．外源藥物(如MEC等)可改變固有膽堿能系統(tǒng)功能狀態(tài)。 二、DC LTB4-BLT信號(hào)通路表達(dá) 目的： 探討DC白三烯B4(leukotriene B4，LTB4)—白三烯B4受體(leukotriene B4 receptor，BLT)信號(hào)通路(LTB4-BLT包括LTB4-BLT1和LTB4-BLT2)存在狀態(tài)。 方法： 1．ELISA方法檢測(cè)幼稚、成熟DC培養(yǎng)上清中LTB4含量。 2．免疫細(xì)胞化學(xué)方法和免疫熒光抗體方法檢測(cè)成熟DC BLT2蛋白定位表 3．RT-PCR方法檢測(cè)幼稚和成熟DC BLT mRNA表達(dá)。 結(jié)果： 1．于2、4和6d(幼稚狀態(tài))和8d(LPS刺激后成熟狀態(tài))，DC培養(yǎng)上清中LTB4含量分別為10.667±2.394pg／ml、7.089±1.810pg／ml、3.222±0.995pg／ml和14.217±3.396pg／ml，隨DC分化進(jìn)行，其培養(yǎng)上清中LTB4含量呈遞減趨勢(shì)。成熟DC較幼稚DC分泌LTB4含量明顯增高(p＜0.05) 2．成熟DC胞膜和胞漿均表達(dá)BLT2，以胞槳特別是細(xì)胞器表達(dá)最強(qiáng)。 3．RT—PCR顯示成熟狀態(tài)和稚狀態(tài)DC均表達(dá)BLT1和BLT2 mRNA，且成熟DC表達(dá)水平較幼稚狀態(tài)DC明顯增強(qiáng)(p＜0.05)。 小結(jié)： 1．DC可通過(guò)分泌LTB4和表達(dá)BLT而建立自身LTB4-BLT信號(hào)通路。 2．成熟DC LTB4-BLT1和LTB4-BLT2信號(hào)通路表達(dá)較幼稚DC增強(qiáng)，成熟DC胞膜和胞漿均表達(dá)BLT2，以胞槳特別是細(xì)胞器表達(dá)最強(qiáng)。該信號(hào)通路可能參與了DC分化、成熟過(guò)程。 3．DC可能通過(guò)上述LTB4-BLT1和LTB4-BLT2兩條信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。 第三部分DC固有膽堿能系統(tǒng)和LTB4-BLT2信號(hào)通路在JIA炎癥反應(yīng)中的作用 目的： 探討DC固有膽堿能系統(tǒng)和LTB4-BLT2信號(hào)通路在JIA炎癥反應(yīng)中的作用。 方法： 1．流式細(xì)胞儀檢測(cè)正常血清組、JIA活動(dòng)期血清組和JIA活動(dòng)期血清+美加明(MEC)組對(duì)DC nAChRα7、BLT2表達(dá)的影響； 2．ELISA方法檢測(cè)正常血清組、JIA活動(dòng)期血清組和JIA活動(dòng)期血清+MEC組作用DC 18h前后，培養(yǎng)上清中IL-12和LTB4含量； 3．流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)正常血清刺激的DC條件培養(yǎng)液組、JIA活動(dòng)期血清刺激的DC條件培養(yǎng)液組、MEC干預(yù)的JIA活動(dòng)期血清刺激的DC條件培養(yǎng)液組對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞活化(CD69表達(dá))的影響； 4．MTT法檢測(cè)正常血清刺激的DC條件培養(yǎng)液組、JIA活動(dòng)期血清刺激的DC條件培養(yǎng)液組、MEC干預(yù)的JIA活動(dòng)期血清刺激的DC條件培養(yǎng)液組對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響； 結(jié)果 1．正常血清組、JIA活動(dòng)期血清組和JIA活動(dòng)期血清+美加明(MEC)組作用成熟DC 18h后DC nAChRα7表達(dá)率(％)分別為：39.80±4.12、52.66±7.99和45.49±7.73。JIA活動(dòng)期血清組與正常血清組比較，nAChRα7表達(dá)明顯增強(qiáng)(p＜0.05)，而美加明(MEC)作用后，nAChRα7表達(dá)下調(diào)。 2．正常血清組、JIA活動(dòng)期血清組和JIA活動(dòng)期血清+美加明(MEC)組作用成熟DC 18h后BLT2表達(dá)率(％)分別為：27.57±2.989，45.947±8.068和67.343±11.394。JIA活動(dòng)期血清組與正常血清組比較，BLT2表達(dá)增強(qiáng)(p＜0.05)；MEC作用后，BLT2表達(dá)更顯著(p＜0.01)。 3．正常血清組、JIA活動(dòng)期血清組、JIA活動(dòng)期血清+MEC組分別作用DC 18h前后，DC培養(yǎng)上清中IL-12、LTB4含量與DC作用前，檢測(cè)實(shí)際為血清中細(xì)胞因子的含量。 1)與DC作用前，JIA活動(dòng)期血清組和正常血清組IL-12含量分別為975.525±206.638pg／ml和23.823±3.555pg／ml，JIA活動(dòng)期血清組比正常血清組IL-12含量明顯增高(p＜0.01)；培養(yǎng)18h后，正常血清組、JIA活動(dòng)期血清組和JIA活動(dòng)期血清+MEC組IL-12含量分別為48.893±9.562pg／ml、1281.175±228.586pg／ml、1618.075±292.81pg／ml，與正常血清組比較增高明顯(p＜0.01)。而JIA活動(dòng)期血清組+MEC組比JIA活動(dòng)期血清組IL-12含量亦有升高(p＜0.05)；同時(shí)，JIA活動(dòng)期血清組IL-12表達(dá)量在DC作用后比作用前亦增強(qiáng)(p＜0.05)。 2) JIA活動(dòng)期血清組和正常血清組LTB4含量分別為82.375±19.9pg／ml和16.9±2.953pg／ml，JIA活動(dòng)期血清組與正常血清組比較明顯增高(p＜0.01)；18h后，正常血清組、JIA活動(dòng)期血清組和JIA活動(dòng)期血清+MEC組LTB4含量分別為24.225±6.264pg／ml、114.575±20.375pg／ml和142.05±24.574pg／ml。JIA活動(dòng)期血清組、JIA活動(dòng)期血清+MEC組LTB4表達(dá)量比正常血清組增高明顯(p＜0.01)。同時(shí)，JIA活動(dòng)期血清+MEC組LTB4含量比JIA活動(dòng)期血清組亦增高(p＜0.05)；JIA活動(dòng)期血清組與作用18h前比較，LTB4含量的增高亦有差異性(p＜0.05)。 4．正常血清刺激的DC條件培養(yǎng)液組、JIA活動(dòng)期血清刺激的DC條件培養(yǎng)液組、MEC干預(yù)的JIA活動(dòng)期血清刺激的DC條件培養(yǎng)液組聯(lián)合小劑量刀豆蛋白(Concanvalin A ConA)體外刺激淋巴細(xì)胞8h，CD69表達(dá)率(％)分別為：3.4±0.683、34.35±5.17、43.35±7.12。JIA活動(dòng)期血清刺激的DC條件培養(yǎng)液組、MEC干預(yù)的JIA活動(dòng)期血清刺激的DC條件培養(yǎng)液組比正常血清刺激的DC條件培養(yǎng)液組CD69表達(dá)水平顯著增高(p＜0.01)。同時(shí)，MEC干預(yù)的JIA活動(dòng)期血清刺激的DC條件培養(yǎng)液組與無(wú)MEC干預(yù)的JIA活動(dòng)期血清刺激的DC條件培養(yǎng)液組比較，CD69亦增高(p＜0.05)。 5．正常血清刺激的DC條件培養(yǎng)液組、JIA活動(dòng)期血清刺激的DC條件培養(yǎng)液組、MEC干預(yù)的JIA活動(dòng)期血清刺激的DC條件培養(yǎng)液組聯(lián)合小劑量ConA對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖結(jié)果(SI值)分別是：1.979±0.307、3.053±0.432、3.672±0.817。MEC干預(yù)的JIA活動(dòng)期血清刺激的DC條件培養(yǎng)液組增殖作用最強(qiáng)，與JIA活動(dòng)期血清刺激的DC條件培養(yǎng)液組比較(p＜0.05)。與正常血清刺激的DC條件培養(yǎng)液組比較增殖作用顯著(p＜0.01)。 小結(jié)： 1．JIA活動(dòng)期血清能刺激DC，使nAChRα7和BLT2表達(dá)上調(diào)，MEC則下調(diào)nAChRα7表達(dá)，抑制膽堿能系統(tǒng)的抗炎作用。 2．DC固有膽堿能系統(tǒng)功能抑制，可引起LTB4-BLT2信號(hào)通路活化，加強(qiáng)炎癥反應(yīng)。 3．DC膽堿能系統(tǒng)功能抑制，可促進(jìn)IL-12和LTB4等炎性因子分泌而增強(qiáng)炎癥反應(yīng)。 DC固有膽堿能系統(tǒng)調(diào)節(jié)紊亂以及LTB4-BLT2信號(hào)通路活化所致的炎癥放大反應(yīng)和免疫細(xì)胞過(guò)渡活化可能參與了JIA的炎癥病理過(guò)程。 總結(jié) 1．DC存在固有膽堿能系統(tǒng)成分(nAChRα7、ChAT和AChE)以及LTB4-BLT信號(hào)通路。 2．JIA活動(dòng)期血清能增強(qiáng)DC nAChRα7和LTB4-BLT2表達(dá)，MEC能抑制nAChRα7表達(dá)，增強(qiáng)LTB4-BLT2表達(dá)，并引起DC致炎因子(LTB4，IL-12)分泌升高。提示：DC固有膽堿能系統(tǒng)功能失調(diào)和LTB4-BLT2信號(hào)通路活化可能參與了JIA炎癥病理過(guò)程。 3．JIA活動(dòng)期血清刺激的DC條件培養(yǎng)液明顯促進(jìn)淋巴細(xì)胞活化(CD69表達(dá))、增殖。MEC干預(yù)后，上述作用更顯著。提示：DC及其固有膽堿能系統(tǒng)參與了淋巴細(xì)胞的增殖活化調(diào)控，該作用失調(diào)，會(huì)造成免疫細(xì)胞的異�；罨� 結(jié)論：DC膽堿能系統(tǒng)功能抑制和LTB4-BLT2信號(hào)通路活化可能參與了JIA發(fā)病的炎癥過(guò)程。通過(guò)激活DC膽堿能系統(tǒng)和阻斷LTB4-BLT2信號(hào)通路可能是控制JIA等自身免疫病的有效途徑。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類(lèi)號(hào)】：R725.9
【圖文】：

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院博士研究生畢業(yè)論文圖1一loc形態(tài)學(xué)改變樹(shù)突形狀的幼稚DC(6d)(xZOO)圖1一Zoc形態(tài)學(xué)改變典型樹(shù)突形狀的成熟DC(8d)(xZOO)二、流式細(xì)胞儀分析DC表面標(biāo)志分子CDI:e、MHC一11及CD80、CD86表達(dá)DC相對(duì)特異標(biāo)志分子CD，，c、組織相容性復(fù)合分子MHC一n、共刺激分子CD80(B7一1)和CD86(B7一2)隨DC(P(0.01)。(表1一1和圖1一3，的成熟表達(dá)明顯增多，成熟狀態(tài)與幼稚狀態(tài)比較1一4)。表1一1幼稚和成熟 DCCDlle、MHC一11、CD80和CD86表達(dá)百分?jǐn)?shù)(%)(x士s，n=3)表型分子幼稚DC成熟DC CDllC41.783士6.10675.687土 11.671*申MHC一11767士9.199.今…電‘上Q口11

本文編號(hào)：2773398