【摘要】：在過(guò)去20年里,大量研究證實(shí)世界范圍內(nèi)過(guò)敏性疾病的發(fā)病率逐年增加,其原因不十分清楚�！靶l(wèi)生假說(shuō)”為兒童在生命早期缺乏微生物的暴露導(dǎo)致今后過(guò)敏性疾病的發(fā)生進(jìn)行了解釋,由于缺乏微生物刺激導(dǎo)致Th1/Th2平衡紊亂和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能低下。越來(lái)越多研究認(rèn)為,兒童早期缺乏微生物接觸導(dǎo)致的過(guò)敏與今后發(fā)生哮喘和過(guò)敏性疾病的風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。雖然過(guò)敏和哮喘具有遺傳傾向性,但基因與環(huán)境的相互作用更能解釋發(fā)病機(jī)制。環(huán)境因素如感染、接觸過(guò)敏原以及產(chǎn)前因素如母親吸煙、孕期營(yíng)養(yǎng)、產(chǎn)婦精神壓力、分娩方式和新生兒期應(yīng)用抗生素等均會(huì)影響小兒今后過(guò)敏性疾病和支氣管哮喘的發(fā)生。通過(guò)基因與環(huán)境的相互作用、表觀遺傳學(xué)以及分子生物學(xué)深入研究,力圖解開(kāi)假定風(fēng)險(xiǎn)與過(guò)敏性疾病和支氣管哮喘發(fā)生的關(guān)聯(lián)。有關(guān)哮喘和過(guò)敏性紫癜的流行病學(xué)資料、危險(xiǎn)因素調(diào)查以及病理機(jī)制有待進(jìn)一步解釋,了解這些機(jī)理對(duì)減少哮喘發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)及尋找切實(shí)有效的藥物干預(yù)微生態(tài)生境,調(diào)整免疫功能對(duì)過(guò)敏性疾病的預(yù)防是十分必要的。 第一部分:腸道微生態(tài)學(xué)變化、CD4+T細(xì)胞亞群及相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子在兒童支氣管哮喘病理機(jī)制中的調(diào)控作用 目的:探討腸道微生態(tài)環(huán)境變化以及免疫網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中CD4+T亞群及相應(yīng)細(xì)胞因子和上游轉(zhuǎn)錄因子在支氣管哮喘病理機(jī)制中的相互調(diào)控作用。 方法:采用流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry,FCM)對(duì)47例支氣管哮喘患兒和32例健康對(duì)照組兒童外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell , PBMC )測(cè)定CD3+CD8-INF-γ+ IL-4- ( Th1 )、CD3+CD8-INF-γ- IL-4(+Th2)、CD4+CD25+T細(xì)胞(Treg)和CD3+CD8-IL-17+( Th17)細(xì)胞百分比;采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)( Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)測(cè)定血漿中細(xì)胞因子INF-γ、IL-4、TGF-β1和IL-17水平;T-bet是調(diào)控Th1細(xì)胞分化、GATA3是調(diào)控Th2細(xì)胞分化、Foxp3是調(diào)控調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化、ROR-γt是Th17分化的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子,采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)( Reverse transcription-polymerase chain reaction ,RT-PCR)檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)T-bet、GATA3、Foxp3和ROR-γt mRNA的表達(dá);采用細(xì)菌16S rDNA方法測(cè)定糞便中雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌和腸球菌含量。 結(jié)果:支氣管哮喘患兒在急性發(fā)作期時(shí)發(fā)生腸道菌群失調(diào),表現(xiàn)在雙歧桿菌和乳酸桿菌為代表的厭氧菌數(shù)量下降,大腸桿菌和腸球菌為代表的需氧菌數(shù)量變化不大,雙大腸桿菌歧桿菌/(Bifidobacteria/ escherichia coli, B/E)值下降。隨著治療和癥狀改善,恢復(fù)期時(shí)雙歧桿菌數(shù)量上升較其他細(xì)菌為快,但整體菌群結(jié)構(gòu)并未扶正。對(duì)于免疫學(xué)指標(biāo)的觀察發(fā)現(xiàn),支氣管哮喘患兒在急性發(fā)作期時(shí)外周血PBMC中Th2和Th17細(xì)胞百分比以及血漿中Th2和Th17細(xì)胞因子IL-4和IL-17濃度均高于健康對(duì)照組;Th1和Treg細(xì)胞百分比以及血漿中Th1和Treg細(xì)胞因子INF-γ和TGF-β1濃度均低于健康對(duì)照組,出現(xiàn)Th1/Th2和Treg/Th17失衡。緩解期Th2和Th17細(xì)胞百分比及血漿相應(yīng)細(xì)胞因子濃度隨疾病的回復(fù)而降低,但仍高于健康對(duì)照組,仍存在免疫紊亂。支氣管哮喘患兒Th1細(xì)胞與血漿中INF-γ濃度和外周血PBMC中T-bet表達(dá)呈正相關(guān);Th2細(xì)胞與血漿中IL-4濃度和外周血PBMC中GATA3表達(dá)呈正相關(guān);Treg細(xì)胞與血漿中TGF-β1濃度和外周血PBMC中Foxp3表達(dá)呈正相關(guān);Th17細(xì)胞與血漿中IL-17濃度和外周血PBMC中ROR-γt表達(dá)呈正相關(guān),表明Th1/Th2和Treg/Th17主要受其特異性轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。腸道菌群中B/E值與Th1/Th2和Tregs/Th17之間均呈正相關(guān)關(guān)系。 結(jié)論:Th1/Th2細(xì)胞分化失衡在支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用,除了Th2細(xì)胞免疫應(yīng)答活躍外,調(diào)節(jié)性T細(xì)胞以及Th17細(xì)胞也參與了在支氣管哮喘的發(fā)病過(guò)程中,表明除了經(jīng)典的Th1/Th2免疫失衡外,還存在Treg/Th17免疫失調(diào)。腸道共生菌刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)的發(fā)育,在支氣管哮喘中通過(guò)下調(diào)Th2應(yīng)答,糾正Th1/Th2失衡。腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能的完整性對(duì)維系CD4+CD25+T細(xì)胞功能發(fā)重要作用,支氣管哮喘患兒腸道菌群失調(diào)損傷了CD4+CD25+T細(xì)胞的免疫抑制功能,導(dǎo)致免疫耐受被打破是支氣管哮喘病理過(guò)程的重要機(jī)制。其研究結(jié)論為今后藥品的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用,并在早期及時(shí)恢復(fù)腸道微生態(tài)平衡,阻斷異常免疫的某個(gè)環(huán)節(jié),防治支氣管哮喘提供了重要理論依據(jù)。 第二部分:腸粘膜屏障功能、CD4+T細(xì)胞亞群及相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子在兒童過(guò)敏性紫癜病理機(jī)制中的調(diào)控作用 目的:探討腸粘膜屏障功能變化及其免疫網(wǎng)絡(luò)中CD4+T亞群及相應(yīng)細(xì)胞因子和特異性轉(zhuǎn)錄因子在過(guò)敏性紫癜病理機(jī)制中的相互調(diào)控作用。 方法:采用流氏細(xì)胞術(shù)測(cè)定41例過(guò)敏性紫癜患兒和30例健康兒童外周血單個(gè)核細(xì)胞CD3+CD8-INF-γ+ IL-4(-Th1), CD3+CD8-INF-γ- IL-4+(Th2),CD4+CD25+T細(xì)胞(Treg)和CD3+CD8-IL-17+(Th17)細(xì)胞百分比;采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定血漿中INF-γ、IL-4、TGF-β1、IL-9和IL- 17細(xì)胞因子水平;T-bet是調(diào)控Th1細(xì)胞分化,GATA3是調(diào)控Th2細(xì)胞分化,Foxp3是調(diào)控調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化,ROR-γt是控制Th17分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子,由逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)外周血PBMC內(nèi)T-bet、GATA3、Foxp3和ROR-γt mRNA表達(dá);采用細(xì)菌16S rDNA方法測(cè)定糞便中雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌和腸球菌含量。采用液相色譜儀測(cè)定尿中乳果糖(lactulose, L)與甘露醇(mannito, M)水平,計(jì)算L/M值評(píng)價(jià)腸粘膜通透性。 結(jié)果:過(guò)敏性紫癜患兒在急性期即發(fā)生腸道菌群失調(diào),表現(xiàn)為腸道中雙歧桿菌和乳酸桿菌下降,大腸桿菌和腸球菌減少不明顯,以乳酸桿菌數(shù)量下降為顯著。治療后隨著臨床癥狀的改善,恢復(fù)期時(shí)雙歧桿菌數(shù)量上升較乳酸桿菌為快,腸道仍處于微生態(tài)紊亂狀態(tài),并且腸道中乳酸桿菌數(shù)量和B/E值和尿L/M值呈負(fù)相關(guān)。在過(guò)敏性紫癜急性期時(shí),外周血PBMC中Th2和Th17細(xì)胞亞群百分比以及血漿中IL-4、IL-17水平和特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA3、ROR-γt mRNA表達(dá)均高于健康對(duì)照組;Th1和Treg細(xì)胞百分比以及血漿中INF-γ、TGF-β1水平和特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet、Foxp3 mRNA表達(dá)均低于健康對(duì)照組,出現(xiàn)Th1/Th2和Treg/Th17免疫失衡�；謴�(fù)期時(shí)Th2和Th17細(xì)胞百分比及IL-4、IL-17水平和特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA3和ROR-γt表達(dá)有所下降,但仍存在Th1/Th2、Treg/Th17免疫失衡。過(guò)敏性紫癜患兒血漿中INF-γ與外周血PBMC中Th1細(xì)胞百分比、T-bet表達(dá)呈正相關(guān);IL-4與外周血PBMC中Th2細(xì)胞百分比、GATA3表達(dá)呈正相關(guān);TGF-β1與外周血PBMC中Treg細(xì)胞百分比、Foxp3表達(dá)呈正相關(guān);IL-17與外周血PBMC中Th17細(xì)胞百分比、ROR-γt表達(dá)呈正相關(guān)。腸道菌群中B/E值和乳酸桿菌數(shù)量分別與Th1/Th2和Tregs/Th17呈正相關(guān),與尿L/M比值呈負(fù)相關(guān)。 結(jié)論:過(guò)敏性紫癜患兒在急性期出現(xiàn)腸道微生態(tài)失衡,表現(xiàn)在腸道菌群B/E值下降,乳酸桿菌數(shù)量下降尤為顯著,腸粘膜通透性下降,腸粘膜屏障功能遭到損壞,腸道共生菌所誘導(dǎo)的免疫耐受機(jī)制被打破,表現(xiàn)在外周血PBMC中CD4+CD25+T細(xì)胞百分比降低及其血漿TGF-β1水平降低,轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)下降,對(duì)以往經(jīng)典的Th1/Th2細(xì)胞免疫失衡的發(fā)病理論進(jìn)行了修訂,認(rèn)為過(guò)敏性紫癜的發(fā)病機(jī)制除了有Th1/Th2免疫失衡外,也存在Treg/Th17的免疫失調(diào),并參與了疾病的病理過(guò)程。腸道乳酸桿菌和雙歧桿菌在恢復(fù)機(jī)體免疫自穩(wěn)狀態(tài),誘導(dǎo)免疫耐受方面發(fā)揮重要作用。研究結(jié)論從微生態(tài)學(xué)和免疫學(xué)角度闡明了過(guò)敏性紫癜的發(fā)病機(jī)制,探討了腸道共生菌、免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子以及轉(zhuǎn)錄因子在疾病發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控作用,為今后藥品的開(kāi)發(fā)不僅限于調(diào)整宿主的免疫功能,更要放眼于改善腸道微生態(tài)環(huán)境,為過(guò)敏性紫癜的臨床治療提供前期的理論依據(jù)。 第三部分參芪健脾方對(duì)腸道菌群失調(diào)大鼠腸粘膜屏障功能修復(fù)及免疫功能調(diào)整作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究 目的:前兩部分研究已表明兒童過(guò)敏性疾病如支氣管哮喘和過(guò)敏性紫癜的病理過(guò)程均發(fā)生腸道微生態(tài)失調(diào)和免疫調(diào)控機(jī)能失衡,故尋求改善微生態(tài)生境,調(diào)節(jié)免疫功能的藥物,早期阻斷疾病的惡性循環(huán),防治過(guò)敏性疾病十分重要。本實(shí)驗(yàn)探討參芪健脾方對(duì)腸道菌群失調(diào)大鼠修復(fù)腸粘膜屏障功能、抑制腸道細(xì)菌移位和調(diào)整免疫功能的作用機(jī)制研究,對(duì)開(kāi)發(fā)中藥方劑防治過(guò)敏性疾病具有重要臨床價(jià)值。 方法:采用細(xì)菌培養(yǎng)法動(dòng)態(tài)測(cè)定大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)變化及腸系膜淋巴結(jié)、肝臟、脾臟和結(jié)腸組織的移位細(xì)菌量;應(yīng)用光鏡和電子顯微鏡觀察大鼠腸粘膜組織超微結(jié)構(gòu)變化;采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)動(dòng)態(tài)測(cè)定大鼠腸系膜淋巴結(jié)、肝臟、脾臟和腸粘膜組織中Toll樣受體mRNA轉(zhuǎn)錄水平。 結(jié)果:腸道菌群失調(diào)模型建立,大鼠腸道中雙歧桿菌、乳酸桿菌和腸桿菌數(shù)量均較對(duì)照組下降。腸粘膜組織受損,表現(xiàn)在腸絨毛、腸上皮細(xì)胞以及緊密連接的受損。大鼠體內(nèi)Toll樣受體mRNA轉(zhuǎn)錄水平早期受抑制,腸系膜淋巴結(jié)、腸粘膜、肝臟和脾臟組織出現(xiàn)腸道細(xì)菌移位情況。大腸桿菌攻擊可加重腸道菌群失調(diào)和腸粘膜損傷程度,上調(diào)Toll樣受體mRNA轉(zhuǎn)錄水平,加劇細(xì)菌移位程度。參芪健脾方和乳酸桿菌可減輕由腸道菌群失調(diào)引起的Toll樣受體mRNA轉(zhuǎn)錄受抑及細(xì)菌移位程度,扶正腸菌群結(jié)構(gòu),修復(fù)損傷的腸粘膜屏障功能。 結(jié)論:闡明了腸道菌群、腸粘膜屏障功能和腸道細(xì)菌移位以及免疫功能之間的互為因果,相互影響的關(guān)系。腸道菌群失調(diào)改變了腸道微生態(tài)生境,損傷了腸粘膜上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu),促發(fā)腸道細(xì)菌移位,致使Toll樣受體mRNA轉(zhuǎn)錄受抑。參芪健脾方在維護(hù)機(jī)體微生態(tài)平衡、修復(fù)腸粘膜屏障功能和抑制腸道細(xì)菌移位方面相同于乳酸桿菌制劑,參芪健脾方可調(diào)整機(jī)體免疫功能,尤其是天然免疫的模式識(shí)別受體,對(duì)于過(guò)敏性疾病的早期防治具有臨床價(jià)值。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R285;R725.9

【引證文獻(xiàn)】

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1 鄭秀麗;基于肺腸微生態(tài)和MEK/ERK信號(hào)通路探討肺與大腸病理傳變的生物學(xué)基礎(chǔ)[D];成都中醫(yī)藥大學(xué);2013年

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1 薛平燕;腸道菌群與非酒精性脂肪性肝病的關(guān)系[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2013年

本文編號(hào)：2772518