【摘要】： 目的研究人胚肺成纖維(human embryonic lung fibroblastic，HEL)細(xì)胞細(xì)胞周期相關(guān)因子Cdt1與Geminin的表達(dá)狀態(tài)及人類巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)感染對兩者表達(dá)的影響，探討HCMV感染可能的發(fā)病機(jī)制。 方法用血清饑餓法同步化HEL細(xì)胞于G_0／G_1期，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期；用HCMV感染同步化的HEL細(xì)胞作為感染組，同時設(shè)模擬感染組為對照組。用倒置相差顯微鏡觀察兩組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化至感染后168小時。于感染后12h(hour)、24h、48h、72h和96h收獲細(xì)胞，提取總的RNA，采用半定量逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)(RT—PCR)技術(shù)檢測Cdt1-mRNA和Geminin-mRNA的表達(dá)水平。 結(jié)果 1、模擬感染組未見細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，感染組感染后36h即可見局部細(xì)胞變圓、膨脹，胞體及胞核巨大化，168h時可見所有細(xì)胞均發(fā)生病變。2、分別用含O．5％，1％，2％和10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HEL細(xì)胞，48小時后收獲細(xì)胞，結(jié)果顯示處于G_0／G_1期的HEL細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)分別為82.8％，78.4％，69.9％，43.8％。新生牛血清濃度為0.5％時，細(xì)胞同步化較理想，所同步化的HEL細(xì)胞可用于試驗。 3、12h、24h、48h和72h兩組HEL細(xì)胞Cdt1-mRNA表達(dá)水平均有顯著性差異(P＜0.05)，12h和24h感染組較模擬感染組明顯降低，48h和72h時感染組較模擬感染組明顯升高。將其制成時間與Cdt1-mRNA表達(dá)水平線圖顯示，模擬感染組在感染后12h時Cdt1-mRNA表達(dá)水平最高，感染組在感染后48h達(dá)最高峰。 4、12h、24h、48h和72h兩組HEL細(xì)胞Geminin-mRNA表達(dá)水平均有顯著性差異(P＜0.05)，12h和24h感染組較模擬感染組明顯增加，48h和72h時模擬感染組較感染組明顯升高。將其制成時間與Geminin-mRNA表達(dá)水平線圖顯示，感染組在感染后12h時Geminin-mRNA表達(dá)水平最高，模擬感染組在感染后48h達(dá)最高峰。 結(jié)論： 1、血清饑餓法將絕大部分HEL細(xì)胞同步于G_0／G_1期，0.5％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基饑餓HEL細(xì)胞同步化效果較佳。 2、HCMV能誘導(dǎo)Cdt1及Geminin因子表達(dá)異常，使Geminin／Cdt1平衡失調(diào)，這可能是HCMV感染導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯于G_1期的機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R725.1
【圖文】：

1、感染后兩組HEL細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變鏡下觀察100TCIDS。的 HCMVAD.。。株感染G。/G，期同步的HEL細(xì)胞36h后，可見有小灶狀細(xì)胞體積膨脹變圓，并遂漸向四周擴(kuò)散(圖3一1)。隨感染時間的延長病變加重，于168h后，全部細(xì)胞發(fā)生病變“++++”(圖3一2)。而模擬感染組HEL細(xì)胞在各時間點均未見形態(tài)學(xué)改變，呈纖維狀，細(xì)胞核橢圓形(圖3一3)。圖3一 1HCMV感染36h后HEL細(xì)胞形態(tài)變化 (x100)圖3一 2HCMy感染168h后HEL細(xì)胞形態(tài)變化 (x100)圖3一3模擬感染組HEL細(xì)胞未見形態(tài)學(xué)改變(”100)2、流式細(xì)胞術(shù)檢測血清饑餓后的HEL細(xì)胞周期流式細(xì)胞術(shù)檢測血清饑餓后的HEL細(xì)胞周期結(jié)果為:新生牛血清濃度為0.5%，1%，2%及10%的DMEM培養(yǎng)基誘發(fā)細(xì)胞同步化處于G0/G;期細(xì)胞的百分率分別為82.8%(圖3一4)70.4%(圖3一5)，69.9%(圖3一6)，43.8%(圖3一7)。 00000O‘今曰曰己11﨑。Nquln一一。Ot二》r、丁2月‘《二李《:

圖3一 1HCMV感染36h后HEL細(xì)胞形態(tài)變化 (x100)圖3一 2HCMy感染168h后HEL細(xì)胞形態(tài)變化 (x100)圖3一3模擬感染組HEL細(xì)胞未見形態(tài)學(xué)改變(”100)2、流式細(xì)胞術(shù)檢測血清饑餓后的HEL細(xì)胞周期流式細(xì)胞術(shù)檢測血清饑餓后的HEL細(xì)胞周期結(jié)果為:新生牛血清濃度為0.5%，1%，2%及10%的DMEM培養(yǎng)基誘發(fā)細(xì)胞同步化處于G0/G;期細(xì)胞的百分率分別為82.8%(圖3一4)70.4%(圖3一5)，69.9%(圖3一6)，43.8%(圖3一7)。O‘今曰曰

3.1RNA抽提結(jié)果紫外分光光度計測總RNA的OD值，0D260/OD280比值為1.8~2.0，表明所提總RNA濃度和純度較高，從1.5%的瓊脂糖凝膠電泳圖觀察總RNA的質(zhì)量(圖3一8)，可作為逆轉(zhuǎn)錄的模板。281855S圖3一8總RNA電泳圖注:泳道1、2分別表示模擬感染組及感染組所提取RNA 3.2CdtlmRNA與p一 aetinmRNA同管擴(kuò)增產(chǎn)物以逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，將Cdt卜mRNA與p一 actinmRNA同管擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，于近SOObp和300bp處分別可見一目的條帶出現(xiàn)(圖3一9)。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 劉志峰;巨細(xì)胞病毒對細(xì)胞周期的影響及其機(jī)制[J];國外醫(yī)學(xué).病毒學(xué)分冊;2002年04期

2 李建華;陳利玉;;人巨細(xì)胞病毒主要立即早期蛋白功能研究進(jìn)展[J];實用預(yù)防醫(yī)學(xué);2006年04期

3 宋春嬌,呂冰潔,張小玲,史忠誠,傅松濱,李璞,李鈺;血清饑餓法用于細(xì)胞周期同步化的方法學(xué)研究[J];中國地方病學(xué)雜志;2003年04期

本文編號：2747128