NRGβ1對少突膠質(zhì)前體細胞保護作用及在新生鼠腦缺氧性損傷中應(yīng)用的探討

發(fā)布時間：2020-07-05 07:10

【摘要】： 新生兒缺血缺氧性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage HIBD)是造成兒童神經(jīng)系統(tǒng)傷殘的主要原因之一,病理學(xué)證實其主要病變是少突膠質(zhì)細胞尤其是少突膠質(zhì)前體細胞以及髓鞘的病變而引起的腦白質(zhì)損傷。Neuregulin 1(NRG1)是一種細胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白,在腦組織內(nèi)由神經(jīng)膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元產(chǎn)生。它能促進少突膠質(zhì)細胞存活、遷移、增殖和分化,也可以促進髓鞘形成。NRG1在缺氧誘導(dǎo)的少突膠質(zhì)前體細胞損傷中是否有保護作用?是否能促進因缺氧而引起的腦白質(zhì)損傷的修復(fù)?為了探討這些問題,本實驗通過體外體內(nèi)兩部分四個分題進行研究。論文1:少突膠質(zhì)細胞原代純化培養(yǎng)及細胞體外缺氧模型建立目的純化培養(yǎng)大鼠大腦皮層O2A細胞,觀察其形態(tài),并研究不同培養(yǎng)條件對其生長和分化的影響;以及建立體外O2A細胞缺氧培養(yǎng)模型。方法采用兩次恒溫搖床振蕩培養(yǎng)法,倒置顯微鏡結(jié)合免疫熒光染色法鑒定細胞種類并判斷純度,缺氧聯(lián)合低糖培養(yǎng)建立細胞體外缺氧模型,透射電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu),臺盼藍染色計數(shù)細胞存活率,流式細胞儀定量分析細胞凋亡情況。結(jié)果O2A祖細胞胞體呈圓形,常有單極或雙極突起,形成克隆球,A2B5標記陽性,免疫熒光鑒定細胞純度可達90%以上。生長因子PDGF和bFGF對O2A細胞的存活和增殖及其重要。O2A細胞具有雙向分化的能力,在不同誘導(dǎo)條件下可分化為星型膠質(zhì)細胞或少突膠質(zhì)細胞。電鏡觀察O2A祖細胞呈圓形或橢圓形,核仁可見,胞漿內(nèi)細胞器少,核周見成束胞質(zhì)絲。缺氧培養(yǎng)3h細胞變化不明顯,但缺氧培養(yǎng)6h,細胞存活率明顯下降(P0.01),凋亡細胞明顯增多(P0.01),并且隨著缺氧時間延長存活細胞更少,凋亡細胞更多,至缺氧培養(yǎng)12h,大多數(shù)細胞破碎。結(jié)論1.選擇合適的培養(yǎng)基對O2A細胞純化培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化極其重要。 2.低糖聯(lián)合缺氧培養(yǎng)模式可以建立可行的O2A細胞體外缺氧模型。論文2: NRGβ1對缺氧培養(yǎng)O2A細胞保護作用及PI3K-Akt信號通路在其中的調(diào)控作用目的研究NRGβ1對缺氧培養(yǎng)O2A細胞損傷的保護作用,并探討其主要的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。方法原代純化的O2A細胞分為缺氧聯(lián)合低糖培養(yǎng)組和NRGβ1干預(yù)組,NRGβ1干預(yù)組指在缺氧培養(yǎng)之前在培養(yǎng)液中加入兩種濃度的NRGβ1。臺盼藍染色計數(shù)細胞存活率,Hoechest33258染色和流式細胞儀觀測細胞凋亡情況,western blot法測定Akt和p-Akt蛋白的表達并定量分析。結(jié)果NRGβ1干預(yù)組O2A細胞存活率高于缺氧培養(yǎng)組(P0.05或P0.01),且凋亡的O2A細胞減少(P0.05或P0.01),NRGβ1對細胞的保護呈劑量依賴性。NRGβ1可以上調(diào)因缺氧培養(yǎng)而降低的p-Akt的表達,但該作用被Ly294002所阻斷。結(jié)論NRGβ1對缺氧培養(yǎng)的O2A細胞有保護作用,且該作用可能與PI3K依賴的p-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活有關(guān)。論文3. 3日齡新生鼠腦白質(zhì)損傷模型建立及超微病理學(xué)研究目的建立新生鼠腦白質(zhì)損傷的動物實驗?zāi)Ｐ?并研究其膠質(zhì)細胞和髓鞘的超微結(jié)構(gòu)變化。方法80只3日齡(P3)SD大鼠隨機分為假手術(shù)組(sham)和缺血缺氧(HI)組,每組各40只。sham組僅分離右側(cè)頸總動脈,HI組行右側(cè)頸總動脈結(jié)扎術(shù),術(shù)后吸6%氧氣-94%氮氣混合氣體3h,建立P3大鼠缺血缺氧模型。觀察兩組大鼠(每組n=20)生理和神經(jīng)學(xué)行為包括體重變化,睜眼時間,懸崖逃避能力,雙臂懸吊能力。取P14,P21大鼠腦組織各10只進行常規(guī)病理HE染色,免疫組化染色以及電鏡觀察膠質(zhì)細胞和髓鞘的變化。結(jié)果HI組大鼠生長緩慢,睜眼時間延遲,懸崖逃避能力及雙臂懸吊能力均發(fā)育緩慢,有統(tǒng)計學(xué)意義。HE染色見60%(6/10)P14及50% (5/10) P21大鼠腦室周圍白質(zhì)及(或)胼胝體纖維排列紊亂,疏松。MBP免疫組化染色發(fā)現(xiàn)HI組頸動脈結(jié)扎側(cè)腦組織MBP表達減少,電鏡觀察見HI組少突膠質(zhì)細胞可同時出現(xiàn)凋亡和腫脹性死亡兩種改變,髓鞘呈蟲蝕樣改變,髓鞘厚度變薄(P0.05)。結(jié)論P3大鼠單側(cè)頸總動脈結(jié)扎聯(lián)合低氧實驗可以建立腦白質(zhì)損傷的動物模型。少突膠質(zhì)細胞可發(fā)生凋亡和脹亡兩種病變,髓鞘合成減少和異常合成可能并存。論文4: NRGβ1對腦白質(zhì)損傷模型新生鼠的保護作用目的:探討NRGβ1對新生鼠腦白質(zhì)損傷的保護作用。方法: P3大鼠隨機分成假手術(shù)組(sham, n=40),缺氧缺血組(HI, n=40),和NRGβ1治療組(NRGβ1,n=40)。sham組僅分離右側(cè)頸總動脈;HI組行右側(cè)頸總動脈結(jié)扎術(shù),恢復(fù)1～1.5h后腦室內(nèi)注射2ul無菌生理鹽水再放置于含6%氧氣-94%氮氣混合氣體的容器中3h;NRGβ1組行右側(cè)頸總動脈結(jié)扎術(shù),恢復(fù)1～1.5h后腦室內(nèi)注射2ul無菌NRGβ1后再放置于含6%氧氣-94%氮氣混合氣體的容器中3h。觀察各組大鼠生長發(fā)育和神經(jīng)學(xué)行為變化(n=20)包括體重變化,睜眼時間,懸崖回避反應(yīng)時間,雙臂懸掛時間。取各組P7,P14和P21大鼠腦室周圍白質(zhì)(n=5,每個日齡),應(yīng)用Western blot法比較分析各組大鼠腦室周圍白質(zhì)髓鞘堿性蛋白(MBP)合成情況。取各組P21大鼠(n=5)腦室周圍白質(zhì)和胼胝體組織常規(guī)電鏡標本處理后透射電鏡觀察膠質(zhì)細胞和髓鞘的變化。結(jié)果:NRGβ1組大鼠腦室周圍白質(zhì)中少突膠質(zhì)細胞病變與HI組相比較有所減輕,腫脹性死亡和凋亡的少突膠質(zhì)細胞減少,胼胝體超微結(jié)構(gòu)觀察髓鞘病變減輕,髓鞘厚度定量分析發(fā)現(xiàn)髓鞘的厚度也有所增厚(P0.05)。Western blot檢測P7、P14、P21大鼠腦室周圍白質(zhì)MBP表達發(fā)現(xiàn)各組大鼠隨著生長,MBP表達逐步增加。與sham組相比,HI組相應(yīng)日齡大鼠腦白質(zhì)MBP的表達明顯減少(P0.01),而NRGβ1組相應(yīng)日齡者MBP的表達與sham組相比均有恢復(fù)(P0.05)。生理發(fā)育和神經(jīng)行為觀察發(fā)現(xiàn)與HI組比較,NRGβ1組大鼠生長發(fā)育得以改善(體重增加,睜眼時間提早),懸崖回避反應(yīng)時間也縮短(P0.05),但雙臂懸掛能力無明顯改善。結(jié)論:NRGβ1可以減輕HI引起的少突膠質(zhì)細胞的病變,促進髓鞘合成,并使大鼠部分神經(jīng)行為功能得以不同程度恢復(fù)。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R722.1
【圖文】：

混合培養(yǎng),膠質(zhì)細胞,體積,細胞