【摘要】： 第一部分HDM刺激小鼠肺SMAD蛋白表達 目的:探討屋塵螨(HDM)氣道刺激后,不同遺傳背景小鼠肺組織SMAD蛋白表達有何不同。 方法:將A/J和C3H小鼠分別用HDM氣道刺激,在最后一次刺激16小時后,取肺組織,經(jīng)過勻漿處理,提取核蛋白,用western blot免疫印跡法檢測肺組織蛋白中Smad2/3、Smad6的表達。 結(jié)果: A/J和C3H小鼠在HDM氣道刺激16小時后,肺組織Smad6蛋白表達差異明顯,表現(xiàn)為A/J小鼠Smad6升高,而C3H則呈現(xiàn)于A/J相反得變化,Smad6表達降低,而Smad2/3表達則正好相反,A/J降低,C3H增高。 結(jié)論:經(jīng)HDM氣道刺激后,不同遺傳背景小鼠Smad表達有所差異,需要進一步研究驗證其在TGF-β信號傳導中的作用。 第二部分針對小鼠Smad6基因的RNA干擾 目的:針對目的基因Smad6 CDS區(qū)設計siRNA序列,構(gòu)建表達載體,探討感染后BMDC細胞中Smad6基因和蛋白表達狀況。 方法:針對目的基因Smad6 CDS區(qū)設計三條siRNA序列,分別為siRNA1、siRNA2、siRNA3 ,使用siRNA質(zhì)粒表達載體pSIH1-H1-copGFP shRNA Vector進行siRNA表達載體構(gòu)建,對構(gòu)建成功的siRNA重組表達載體進行去內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA抽提,siRNA重組表達載體DNA轉(zhuǎn)染L929細胞,然后Real-time PCR的方法檢測基因干預后L929細胞中Smad6基因表達狀況,使用Lentivirus Pakage systerm進行慢病毒顆粒的包裝和生產(chǎn),測定病毒滴度(梯度稀釋法),再分離C3H/HeJ小鼠骨髓原代BMDC,獲取最佳MOI值以及感染條件,后用慢病毒感染BMDC細胞,RT-PCR和western blot分別檢測感染后細胞中Smad6基因的表達及SMAD6蛋白表達狀況。 結(jié)果: Real Time-PCR檢測結(jié)果顯示,siRNA1對于Smad6基因的沉默效果最好,沉默效率約為67%�？紤]到細胞大約75%的轉(zhuǎn)染效率,實際的基因沉默可能達到90%(mRNA),最佳MOI值為20,Real Time-PCR檢測結(jié)果顯示,通過病毒載體感染BMDC細胞,提示siRNA1對于Smad6基因的沉默效約為85%,而BMDC中蛋白表達被明顯抑制,與對照組有差異有顯著性。 結(jié)論:我們針對目的基因Smad6 CDS區(qū)所設計的siRNA序列而構(gòu)建的表達載體能成功有效抑制Smad6基因和蛋白表達,為后一步的試驗打下了基礎(chǔ)。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R725.6
【圖文】：

圖 1-2 HDM 氣道刺激后小鼠肺組織 Smad2/3 蛋白表達Fig 1-2 Active Smad2/3 expression in nucleus from whole lung cells從圖中可以看出，沒有經(jīng)過 HDM 氣道刺激的 A/J 和 C3H 小鼠 Smad2/3 表達基本沒有差異，而經(jīng)過 HDM 氣道刺激后，二種小鼠均出現(xiàn)變化，具體表現(xiàn)為：A/J 下降，C3H 升高；而 HDM 刺激后 16 小時，A/J 和 C3H 的 Smad2/3 表達也存在明顯差異。（統(tǒng)計學比較：A/J 未刺激與 2h、6h、16h 兩兩比較均有差異，C3H未刺激與 2h、6h 比較有差異，與 16h 比較有顯著差異，2h、6h、16h 之 A/J 與 C3H比較有顯著差異，p<0.05）。2.2 HDM 氣道刺激誘導小鼠肺組織核內(nèi) Smad6 表達

010203040506070unchallenged 2 h 6 h 16 h分組密光度值A(chǔ)/JC3H***圖 1-3 HDM 氣道刺激后小鼠肺組織 Smad6 蛋白表達Fig 1-3 Smad6 expression in nucleus from whole lung cells* vs 未刺激 A/J(unchallenged A/J)** 16h C3H vs 16h A/J,p<0.05

【共引文獻】

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本文編號：2737620