【摘要】： 低堿性磷酸酯酶癥(Hypophospatasia,HPP)是一種常染色體隱性遺傳疾病,由于堿性磷酸酯酶(ALPL)基因突變而導(dǎo)致的以骨骼和牙齒發(fā)育缺陷及血清、骨的組織非特異性堿性磷酸酶(TNAP)活性降低為特征的一種系統(tǒng)性疾病。由于ALPL的等位基因異質(zhì)性,該疾病的臨床表型高度變化,輕者僅表現(xiàn)為乳牙過早脫落,嚴(yán)重情況下可出現(xiàn)嚴(yán)重骨骼異常及高鈣血癥導(dǎo)致圍產(chǎn)期死亡,目前已發(fā)現(xiàn)214個(gè)ALPL基因突變類型可導(dǎo)致HPP疾病的發(fā)生。ALPL編碼的TNAP蛋白不僅在生物礦化過程中具有至關(guān)重要作用,而且可能通過影響相關(guān)干細(xì)胞的生物學(xué)行為導(dǎo)致骨骼及牙齒發(fā)育異常。本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)HPP患兒進(jìn)行基因突變檢測,進(jìn)而體外培養(yǎng)和檢測HPP患兒脫落乳牙牙髓干細(xì)胞(SHED)以及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSC),以期探討ALPL基因突變對(duì)SHED及BMMSC生物學(xué)特性及分化行為的影響,為深入闡明低堿性磷酸酯酶癥的致病機(jī)制提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)和研究基礎(chǔ)。所取的研究結(jié)果如下。 實(shí)驗(yàn)一低堿性磷酸酯酶癥患兒致病基因ALPL突變檢測的研究 本實(shí)驗(yàn)通過PCR及基因測序等方法對(duì)1名HPP患兒致病基因ALPL基因的外顯子(EXON)進(jìn)行基因組DNA序列分析,進(jìn)而檢測基因突變的類型和位點(diǎn)。結(jié)果顯示,該HPP患兒ALPL基因的第7個(gè)外顯子,基因序列第787位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)T→C的錯(cuò)義突變,為雜合型結(jié)構(gòu),該點(diǎn)突變導(dǎo)致密碼子TAC→CAC,可引起編碼蛋白第263位點(diǎn)酪氨酸變成組氨酸,而其家系健康成員及正常對(duì)照均顯示為野生型序列。經(jīng)過數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)檢索,本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的ALPL基因突變型(c.787TC, p.Y263H)未見報(bào)道,初步認(rèn)為此基因型單倍體不足是導(dǎo)致該HPP患兒臨床表型的致病原因。 實(shí)驗(yàn)二低堿性磷酸酯酶癥患兒乳牙牙髓干細(xì)胞的生物學(xué)行為研究 本實(shí)驗(yàn)首先進(jìn)行低堿性磷酸酯酶癥患者乳牙牙髓干細(xì)胞和正常乳牙牙髓干細(xì)胞的體外培養(yǎng),進(jìn)而通過免疫細(xì)胞化學(xué)的方法對(duì)兩組細(xì)胞表面分子標(biāo)記物表達(dá)分析,采用克隆形成率,Ki67陽性率,MTT,流式細(xì)胞方法檢測兩組干細(xì)胞增殖能力及凋亡水平的差異,茜素紅染色,Real-time PCR檢測兩組細(xì)胞的礦化能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn):HPP細(xì)胞的成骨相關(guān)指標(biāo)ALP、BSP、COL1等蛋白表達(dá)水平均略低于正常對(duì)照組;而增殖檢測顯示HPP細(xì)胞的細(xì)胞擴(kuò)增水平較低;運(yùn)用茜素紅染色看出HPP細(xì)胞形成礦化結(jié)節(jié)明顯較少; Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)RUNX2的mRNA表達(dá)下調(diào),而ALP、COL1、DSPP等的表達(dá)上調(diào)。結(jié)果提示HPP細(xì)胞較正常對(duì)照組有著較弱的增殖能力和礦化能力。 實(shí)驗(yàn)三低堿性磷酸酯酶癥患兒骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)行為研究 本實(shí)驗(yàn)首先體外培養(yǎng)低堿性磷酸酯酶癥患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和正常骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,進(jìn)而通過免疫細(xì)胞化學(xué)和流式細(xì)胞方法對(duì)兩組細(xì)胞表面分子標(biāo)記物表達(dá)分析,采用MTT,堿性磷酸酶活性檢測,流式細(xì)胞方法檢測兩組干細(xì)胞增殖能力及凋亡水平的差異,茜素紅染色,ALP活性染色,Real-time PCR檢測兩組細(xì)胞的礦化能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn):HPP細(xì)胞的成骨相關(guān)指標(biāo)ALP、BSP、COL1等蛋白表達(dá)水平均略低于正常對(duì)照組;流式細(xì)胞的表面分子鑒定兩組細(xì)胞表達(dá)量無明顯差異;而增殖檢測顯示HPP細(xì)胞的細(xì)胞擴(kuò)增水平較低;運(yùn)用茜素紅染色和ALP活性染色看出HPP細(xì)胞形成礦化結(jié)節(jié)明顯較少;Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)RUNX2的mRNA表達(dá)下調(diào),而ALPL、COL1、BSP等的表達(dá)上調(diào)。結(jié)果提示HPP細(xì)胞較正常對(duì)照組有著較弱的增殖能力和礦化能力。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R725.9
【圖文】：

患兒ALPL基因EXON7正向測序結(jié)果

患兒ALPL基因EXON7反向測序結(jié)果

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 秦晗;龔永慶;徐宏志;;乳牙早脫1例[J];牙體牙髓牙周病學(xué)雜志;2011年06期

本文編號(hào)：2724615