【摘要】： 目的 先天性馬蹄內(nèi)翻足(congenital clubfoot，CCF)是常見(jiàn)的嚴(yán)重危害兒童健康的先天四肢畸形之一。發(fā)病率為1‰-8‰不等。CCF的病因目前不明確。遺傳流行病學(xué)研究認(rèn)為遺傳因素在CCF的發(fā)病過(guò)程中起著重要作用，一般認(rèn)為屬多基因遺傳。國(guó)內(nèi)對(duì)CCF的病因研究報(bào)道不多，而且大部分從病理學(xué)角度去研究，從分子水平研究其發(fā)病機(jī)理的較少。Hox基因長(zhǎng)久以來(lái)被認(rèn)為是控制脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育及器官形成的主要基因。眾多的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明Hox基因參與調(diào)控肢體的骨骼發(fā)育。最近又有報(bào)道HoxA基因在肢體肌前體的發(fā)育中起重要作用。我科前期研究發(fā)現(xiàn)HoxD基因與CCF存在相關(guān)關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)以HoxA基因作為CCF的候選基因。選擇HoxA所在區(qū)域的微衛(wèi)星位點(diǎn)D7S1808和D7S516對(duì)54個(gè)核心家系進(jìn)行TDT檢驗(yàn)，以確定HoxA基因與CCF的相關(guān)關(guān)系，為揭示CCF的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 方法 1．收集樣本 收集CCF患者及其父母的外周靜脈血2ml。CCF患者均有典型的臨床表現(xiàn)，經(jīng)X光片及手術(shù)確診，并排除其他原因引起的馬蹄內(nèi)翻足樣畸形。 2．選取微衛(wèi)星位點(diǎn) 從人類基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(GDB)選取HoxA基因附近的一個(gè)四核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星DNA標(biāo)記D7S1808和一個(gè)二核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星位點(diǎn)D7S516。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。 3．基因型分析及TDT檢驗(yàn) 飽和氯化鈉法提取基因組DNA。 同位素?fù)饺隤CR擴(kuò)增微衛(wèi)星DNA：PCR反應(yīng)總體積10μl，，其中加入比活度3μCi／pmol、比濃度為10μCi／μl的α~(32)p-dCTP 0.1μl；PCR反應(yīng)條件：D7S1808：94℃ 45sec、56℃ 45sec、72℃ 1min循環(huán)35次。D7S516：94℃ 3Osee、56℃30see、72℃45seC循環(huán)35次。 6%變性聚丙烯酞胺凝膠電泳:取擴(kuò)增產(chǎn)物與變性載樣緩沖液的混合物 3討，經(jīng)6%變性聚丙烯酞胺凝膠電泳分離等位基因，電泳條件:1 xTBE， 80W，循環(huán)水溫度30℃，電泳時(shí)間3一5小時(shí)。 自顯影及洗片:將凝膠轉(zhuǎn)移至濾紙并加蓋保鮮膜，后置于暗盒內(nèi)，一 70℃冰箱自顯影6一18小時(shí)，洗片，照相。 基因型分析及TDT檢驗(yàn):雙盲法判定等位基因型并記錄。建立TDT表 格，計(jì)算XZ值，判定P值，進(jìn)行TDT檢驗(yàn)及相關(guān)分析。 結(jié)果 1 .D7s516位點(diǎn)、D7S1808位點(diǎn)等位片段及核心家系等位片段傳遞情況 檢測(cè)結(jié)果。D7 5516位點(diǎn)可以檢測(cè)出7個(gè)等位片段;D7 51 808位點(diǎn)可以檢測(cè) 出7個(gè)等位片段; 2.TDT檢驗(yàn)結(jié)果。D7S516位點(diǎn)的等位片段傳遞情況;D751808位點(diǎn)等 位片段傳遞情況;TDT檢驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)D7 5516處存在傳遞不平衡(X2=20. ‘3s46P0.01);D7Slsos處不存在傳遞不平衡(XZ=11.3196p0.05); 3.我國(guó)北方人群中D7 51 808位點(diǎn)各個(gè)等位基因的頻率分布情況。 結(jié)論 1.D7ssl6位點(diǎn)可以檢測(cè)出7個(gè)等位基因，它與CCF存在傳遞不平衡， 提示HoxA基因與先天性馬蹄內(nèi)翻足發(fā)病可能有相關(guān)性。 2.D751808位點(diǎn)可以檢測(cè)出7個(gè)等位基因，它與CCF不存在傳遞不平 衡。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R726.8

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2708772