【摘要】： 目的:天然免疫存在于所有多細胞生物,是抗御病原體感染的第一道防線。單核細胞和樹突狀細胞(dendritic cell, DC)是其中重要的效應細胞,作為體內重要的抗原提呈細胞(antigen present cell, APC),具有探測微生物,產生細胞因子,調節(jié)機體免疫反應的能力。新生兒免疫系統(tǒng)發(fā)育不成熟,尤其是先天免疫發(fā)育不健全,調節(jié)性T細胞功能不完善,Th1/Th2細胞比例失衡,免疫反應向Th2型偏斜,易患感染性疾病和變態(tài)反應性疾病。大量實驗證實,腸道共生菌具有促進免疫系統(tǒng)成熟的能力,可激活免疫細胞,促進免疫活性細胞分泌細胞因子,維持Th1/Th2型細胞反應平衡,誘導免疫應答或免疫耐受。本研究采用細胞培養(yǎng)技術以腸道共生菌(雙歧桿菌和大腸桿菌)為刺激物觀察新生兒臍血單核細胞和單核細胞來源的DC的形態(tài)學和免疫學變化:1.觀察雙歧桿菌和大腸桿菌刺激單核細胞所致形態(tài)學變化和產生細胞因子IL-10和IL-12情況,探討其對新生兒全身免疫的作用。2.觀察雙歧桿菌和大腸桿菌刺激DC后的形態(tài)學變化和產生IL-10和IL-12情況,探討其對新生兒局部免疫的作用。研究結論為臨床上合理應用微生態(tài)制劑預防和治療新生兒感染性疾病和變態(tài)反應性疾病提供重要理論依據。 方法:選取正常足月新生兒臍血20例(陰道分娩兒10例、剖宮產兒10例)。每份血樣均采用甲基纖維素沉降臍血紅細胞,利用Ficoll密度梯度法分離單個核細胞(cord blood monocular cells,CB-MNCs),經貼壁培養(yǎng)獲得單核細胞。本實驗分兩部進行 1收集部分單核細胞,分為4組,分別加入熱滅活雙歧桿菌、熱滅活大腸桿菌、熱滅活雙歧桿菌+大腸桿菌和PBS液(對照組),培養(yǎng)24小時觀察單核細胞形態(tài)學變化,取培養(yǎng)上清液ELISA法檢測IL-10和IL-12p70濃度。 2向部分貼壁的單核細胞中加入粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)、IL-4聯(lián)合誘導單核細胞生成DC,培養(yǎng)7天獲得未成熟DC,后分為4組,分別加入熱滅活雙歧桿菌、熱滅活大腸桿菌、熱滅活雙歧桿菌+大腸桿菌和PBS液(對照組)。每日倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)學變化并攝片。取培養(yǎng)上清液行ELISA檢測IL-10和IL-12p70濃度。統(tǒng)計學利用SAS 6.12版統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計計算。采用兩樣本t檢驗、配對t檢驗和卡方檢驗,結果用均數(shù)±標準差( x±s )表示,以α=0.05為檢驗顯著性標準。 結果 1雙歧桿菌、大腸桿菌刺激單核細胞后,未發(fā)現(xiàn)形態(tài)學變化。 2雙歧桿菌、大腸桿菌刺激后單核細胞存活率與對照組無顯著差異,各組存活率均90%。 3雙歧桿菌、大腸桿菌對單核細胞刺激產生不同反應,未加任何刺激物時可分泌少量IL-10和IL-12p70。雙歧桿菌刺激24h后,IL-10和IL-12p70分泌量明顯增高,以IL-12p70增高為著,與對照組比較均有統(tǒng)計學差別(p0.05)。大腸桿菌刺激24h后,IL-10分泌量顯著增多,與對照組和雙歧桿菌組比較均有統(tǒng)計學差別(p0.05),產生IL-12水平低于雙歧桿菌組(p0.05)。兩種菌聯(lián)合刺激后出現(xiàn),IL-12水平與雙歧桿菌組接近(p0.05),高于大腸桿菌組(p0.05)。IL-10水平明顯高于兩單獨刺激組(p0.05)。說明兩種菌聯(lián)合刺激使IL-12、IL-10分泌均保持較高水平。 4體外培養(yǎng)7天可得到未成熟DC,呈懸浮狀態(tài),體積明顯變大,呈多形性,邊緣呈毛茸狀,可見小的突起。雙歧桿菌和大腸桿菌刺激24小時后突起明顯增多,可見刺狀突起及多級突起,并得到有典型樹突狀突起的成熟DC,較對照組有明顯差別。 5雙歧桿菌、大腸桿菌刺激對DC的存活率與對照組無顯著差異,各組存活率均90%。 6未成熟DC在未加任何刺激物時可分泌少量IL-10和IL-12p70,雙歧桿菌刺激24h后,IL-10和IL-12p70分泌量有所增加,與對照組比較均有統(tǒng)計學差別(p0.05),以IL-10增加顯著。大腸桿菌刺激后,IL-10分泌量顯著增多,高于對照組和雙歧桿菌組(p0.05),IL-12水平較對照組增高(p0.05),與雙歧桿菌組相似(p0.05)。兩種菌聯(lián)合刺激后則出現(xiàn),IL-12的水平有所增加,與對照組比較有統(tǒng)計學差別(p0.05),與雙歧桿菌組相似(p0.05),低于大腸桿菌組(p0.05)。但IL-10水平增高明顯,均高于對照組和兩單獨刺激組(p0.05)。 結論 1證實了體外分離、培養(yǎng)足月新生兒臍血單核細胞和單核細胞來源的樹突狀細胞的技術是成熟和成功的。 2雙歧桿菌通過促使新生兒單核細胞分泌IL-12,使免疫反向Th1方向發(fā)展,調節(jié)Th1/Th2免疫應答平衡,激活新生兒免疫功能,增強機體抗感染能力,降低變態(tài)反應性疾病的發(fā)生。 3雙歧桿菌、大腸桿菌通過促使樹突狀細胞分泌IL-10,誘導口服耐受,維持腸道自穩(wěn)狀態(tài),并促使sIgA、IgM等抗體生成,抑制變態(tài)反應性疾病的發(fā)生。 4雙歧桿菌、非致病性大腸桿菌作為腸道共生菌不引起機體的排斥反應,不影響單核細胞和樹突狀細胞的存活,可作為益生菌誘導產生口服免疫耐受。 5腸道共生菌能夠調節(jié)新生兒先天性和獲得性免疫,調節(jié)免疫應答平衡,增強全身和局部免疫功能,對新生兒感染性疾病和變態(tài)反應性疾病有預防和治療作用,為臨床上早期使用微生態(tài)制劑預防和治療新生兒疾病提供了理論依據。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R722.1

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